吗啡通过蛋白激酶C(PKC)途径对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

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目的:本研究旨在探讨μ阿片受体激动剂吗啡对人肝癌Hep G2细胞的增殖和迁移的影响,以及吗啡经蛋白激酶C(PKC)途径抑制Hep G2细胞增殖的相关机制。方法:采用CCK-8法和Transwell法测定吗啡对人肝癌Hep G2细胞增殖和迁移能力的影响,用不同浓度的μ阿片受体激动剂吗啡(药物终浓度分别为0μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L,C1、M1、M2、M3、M4组)随机孵育24h,药物均由含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释配制,每组均设置平行复孔。用25cm2培养瓶将人肝癌Hep G2细胞培养至对数生长期,长满80%~90%,进行细胞计数;计数以细胞密度2×103个/ml接种于96孔培养板中,用CCK-8法检测使用吗啡后的细胞在孵育24h后的细胞增殖活性;计数以5×104个/ml接种在24孔培养板中,使用Transwell法观察Hep G2细胞在孵育24h后的细胞迁移能力的变化;采用q RT-PCR检测Hep G2细胞中的PKC m RNA的表达,采用Western Blotting法检测Hep G2细胞中的p-PKC蛋白的表达。使用药物终浓度为10μmol/L的吗啡组(M组)、10μmol/L的吗啡和100nmol/L的μ阿片受体拮抗剂纳络酮的联合组(M+N组)、10μmol/L的吗啡和300nmol/L的PKC激活剂佛波酯的联合组(M+P组)、10μmol/L的吗啡和25nmol/L的PKC抑制剂Ly317615的联合组(M+L组)、加等量完全培养基的对照组(C组)随机孵育对数生长期的Hep G2细胞,每组均设置平行复孔;采用CCK-8法测使用不同药物后的细胞在分别孵育24h后的增殖活性;计数以3×106个/ml接种6孔培养板中,孵育24h后,采用Western blotting法检测各组hep G2细胞中的p-PKC蛋白的表达。结果:使用不同浓度的吗啡作用于Hep G2细胞后,CCK-8法检测结果显示C1、M1、M2、M3、M4组的24h的波长为490nm的吸光度值(A490值)分别为(0.82±0.08)(0.76±0.09)(0.71±0.10)(0.65±0.06)(0.60±0.07);Transwell迁移实验显示C1、M1、M2、M3、M4组的细胞迁移数分别是(83.65±5.88)(70.36±2.09)(69.72±3.10)(55.65±1.06)(51.65±2.07);上述结果表明吗啡干预Hep G2细胞24h后,吗啡能抑制Hep G2细胞的细胞增殖及细胞迁移。q RT-PCR检测Hep G2细胞的PKC m RNA相对表达量分别是(1.61±0.20)(1.53±0.19)(1.36±0.24)(0.95±0.12)(0.90±0.08);Western blotting检测结果显示Hep G2细胞的p-PKC蛋白的相对表达量为(0.81±0.10)(0.73±0.09)(0.68±0.12)(0.41±0.06)(0.33±0.07);表明浓度为1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的吗啡干预后的Hep G2细胞的PKC m RNA表达及p-PKC蛋白均下调。C组、M组、M+N组、M+P组、M+L组处理Hep G2细胞后,CCK-8法检测结果显示C组及M组、M+N组、M+P组、M+L组的24h吸光度值(A490值)分别为(0.83±0.51)(0.46±0.09)(0.79±0.19)(0.81±0.36)(0.43±0.17),与C组相比较,显示M组和M+L组中人肝癌Hep G2细胞A490值降低;Western blotting法结果显示C组、M组、M+N组、M+P组、M+L组作用下的Hep G2细胞的p-PKC蛋白相对表达量为(0.63±0.51)(0.32±0.09)(0.59±0.19)(0.65±0.36)(0.28±0.07),与C组相比较,M组和M+L组中Hep G2细胞的p-PKC蛋白均下调,而M+N组和M+P组中的Hep G2细胞中的p-PKC蛋白相对表达量没有统计学意义。结论:吗啡能抑制体外人肝癌Hep G2细胞增殖和迁移能力,使用吗啡后的Hep G2细胞中的PKC m RNA和p-PKC蛋白的表达下调,呈现一定的吗啡浓度依赖性。提示吗啡可能经PKC途径抑制体外人肝癌Hep G2细胞增殖抑制。
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