背景终丝及脊髓圆锥以下的神经根构成了马尾神经(cauda equina，CE)，其主要功能包括传导会阴部、马鞍区的感觉，控制大小、便功能及踝、膝或球海绵体反射，一旦损伤，患者可以出现下腰痛、坐骨神经痛以及鞍区感觉减退或缺失、排便障碍及性更能障碍等为主要表现的临床症候群。Mixter等在1934年首次报道，并将其命名为马尾神经综合征(cauda equina syndrome，CES)。大部分腰椎退变、腰椎管狭窄、腰椎间盘突出患者都可以先尝试保守治疗，如果症状未见缓解或继续加重而出现不可耐受的根性痛或运动、感觉功能障碍后，才会进行择期手术治疗，而且大部分患者术后恢复令人满意。而CES却不同，一旦发病，要求进行急诊手术，否则一旦出现神经功能损伤，很难完全恢复。目前马尾神经综合征的发病机制尚不完全清楚，可能是由于神经受到机械性压迫、炎症、静脉充血或缺血等原因导致病变。由于手术减压后病人的症状改善并不确定，因此进一步研究马尾神经损伤的机制及非手术治疗方法显得非常必要。近年来，嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells，OECs）移植被认为是治疗神经系统修复过程的最有前景的方法之一。嗅鞘细胞位于嗅觉系统，是一类独特的神经胶质细胞。它同时存在于外周和中枢神经系统，并兼具雪旺细胞和星型胶质细胞的特点。在生理状态下，嗅神经因与外界接触而易受损伤，因此其终身都在进行更新，在整个过程中，嗅鞘细胞始终包绕着嗅神经轴突，形成神经束，引从嗅上皮（olfactoryepithelium，OE）新生的轴突长入位于中枢的嗅球（olfactory bulb，OB）。嗅鞘细胞具有促进嗅神经轴突生长及再生的能力，同时也具有引导其生长的能力，这一特征被成功地应用于脊髓损伤（Spinal cord injury，SCI）的治疗。大量研究表明，移植到中枢神经损伤处的嗅鞘细胞能形成引导神经突起生长通道，再生的神经轴突可以沿着这一通道向远处延伸，使中枢神经损伤得以修复。移植神经营养因子基因修饰的嗅鞘细胞可明显促进全脊髓横断大鼠皮质脊髓束再生。但目前未见移植嗅鞘细胞治疗马尾神经损伤的相关报道。早期的研究表明马尾神经损害导致背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）内神经元坏死和脊髓后角细胞坏死，采用脑源性神经生长因子（Basic fibroblast growthfactor，BDNF）能够促进轻、中度损害的马尾神经功能恢复，但对于重度损伤的情况效果不理想。嗅鞘细胞的移植是否能够促进马尾神经功能恢复，是否对不同程度损害的马尾神经功能恢复都有改善作用以及嗅鞘细胞移植入体内后是否能达到功能性整合，使损伤的神经结构重建，实现损伤髓鞘的髓鞘化，有待于进一步研究。研究目的通过硅胶条压迫法建立大鼠马尾神经压迫损伤模型。通过显微注射的细胞移植方法向硬膜囊内注射OECs，将其移植到压迫损伤部位的马尾神经表面，明确OECs移植后在局部的存活时间及大鼠马尾神经MBP表达量及神经功能改变情况。研究方法一、采用硅胶条压迫法成功构建椎管狭窄的大鼠马尾神经压迫模型。将SD大鼠的腰4节段咬除椎板上缘，暴露硬膜囊，将10mm×0.8mm×1.0mm的硅胶条置入大鼠L4和L5椎管内，压迫7天，通过BBB评分、甩尾痛觉检测实验，以及免疫组化染色对损伤情况评估。二、原代OECs的培养。取SD大鼠OB嗅神经层OECs进行原代细胞培养，通过差速贴壁及Thy1.1抗体进行细胞纯化，通过OECs特异性标记物p75NTR及S100的抗体标记体外培养的原代OECs，鉴定细胞纯度。三、OECs移植。取GFP转基因大鼠OB进行OECs培养及纯化。取符合条件的SD大鼠造模，筛选造模成功的大鼠，进行手术减压去除压迫硅胶条后硬膜囊内注射8μlGFP-OECs PBS悬液（浓度约1×105/μl），对照组则注射等量的PBS溶液。四、GFP-OECs移植后在不同时间点取细胞移植部位CE制成细胞悬液进行流式细胞检测，观察样本GFP荧光强度。五、细胞移植后在不同时间点提取各组压迫损伤部位的马尾神经组织总蛋白，通过Western blot观察MBP表达水平的变化。六、细胞移植后在不同时间点进行BBB评分和甩尾实验观察手术减压及细胞移植后马尾神经压迫损伤大鼠的功能变化。结果一、硅胶条压迫大鼠马尾神经7天后，大鼠BBB评分逐渐稳定在11分左右，甩尾潜伏期由损伤前的4-6s逐渐延长至12s左右，MBP免疫组化显示大鼠马尾神经出现脱髓鞘表现。通过硅胶条压迫法可以构建稳定的大鼠马尾神经压迫损伤模型。二、所培养的原代OECs纯度达到95%以上，该纯度能够满足后续实验需要。三、OECs移植后2周时，样本的GFP荧光强度高于野生型SD大鼠CE细胞悬液，2周后损伤局部组织的细胞悬液GFP荧光与非转基因大鼠的本底荧光强度无明显差异，说明外源性OECs可在损伤局部存活约2周时间。四、OECs移植后MBP的表达水平在移植后的1天、3天没有显著变化，而在移植后的2-3周MBP蛋白表达水平与对照组相比有提高，4周后蛋白表达水平趋于稳定，提示OECs移植有助于成年大鼠马尾神经损伤后的再髓鞘化。五、OECs移植后BBB评分结果和甩尾实验结果表明，所有大鼠在减压、硬膜囊内注射术后后肢功能逐渐得到一定程度的改善，但是细胞移植组功能恢复并未优于假移植组，提示这些功能恢复是由于手术解除马尾神经压迫后大鼠自身恢复所致。结论OB-OECs可以通过硬膜囊内注射的方法进行移植，并可在损伤局部聚集至少2周的时间。移植组动物的MBP表达量在2-3周时高于对照组，说明，OECs移植后可能通过细胞间的相互作用，如分泌神经营养因子、激活SCs、清除坏死组织等作用而保护脱髓鞘的马尾神经，使其在后续的再髓鞘化过程中更快的恢复。但是硬膜囊内直接注射OECs在4周的时间内并未使实验动物获得明显的功能改善。因此，在OECs移植的具体方法，如注射的细胞量、细胞悬液的介质等方面仍需进一步研究，从而使OECs在马尾神经损伤修复中发挥更多的生物学效应。