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目前,全球糖尿病患者有近3亿,随着人们生活节奏和生活方式的变化,糖尿病正在逐渐蔓延且发病人群向年轻化发展,糖尿病已成为威胁人类健康的重要慢性流行疾病,目前市场急需标本兼治的糖尿病治疗药物。促胰岛素(Incretin)又称胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1),能通过胰岛β细胞表面的特异受体显著增强葡萄糖诱导的胰岛素分泌,有效降低糖尿病患者血糖水平,促进胰岛p细胞胰岛素基因转录和分泌,促进胰岛p细胞再生,抑制胰岛β细胞凋亡,改善和恢复胰岛细胞功能；防止糖尿病各种并发症,抑制胰升血糖素的分泌和糖尿病患者胃的排空,消除其饥饿感,降低血脂,预防冠心病；GLP-1的促胰岛素作用依赖于葡萄糖的浓度,用其治疗糖尿病不会发生低血糖,被认为是一种“治标治本”的糖尿病治疗多肽,对2型糖尿病的预防和治疗具有重要意义。人体内胰高血糖素样肽以有活性的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺形式存在,但是其N端第8位的丙氨酸极易被二肽酶(DPP Ⅳ)切割变成无活性的短肽GLP-1(9-37)或GLP-1(9-36),半衰期仅数分钟,成为GLP-1进入实际应用的主要瓶颈。因此,开发更稳定的GLP-1类似肽,延长其体内有效作用时间成为近年来的热门课题。本实验室前期通过点突变天然GLP-1,克隆了抗DPP-Ⅳ和胰蛋白酶降解的重组口服长效GLP-1类似肽(recombinant oval long-acting GLP-1, rolGLP-1)。动物实验证明,GLP-M蛋白(10tandem repeated rolGLP-1)可显著降低糖尿病大鼠血糖水平,改善了由于高血糖引起的异常体征,对2型糖尿病具有良好的治疗效果。由于GLP-M中各拷贝rolGLP-1之间通过酶切连接,导致两个相邻rolGLP-1之间多出三个氨基酸(脯氨酸-异亮氨酸-精氨酸),并且为了便于蛋白纯化,GLP-M的C端设计了纯化标签(6×His),于是在GLP-1的完整序列外添加了一些冗余氨基酸,虽然短期看不出冗余氨基酸的副作用,但是不能保证长期使用的安全性,而且影响新药审批。为此,我们委托北京擎科生物科技有限公司(Tsingke Biological Technology Co.,Ltd, Beijing)合成了十拷贝rolGLP-1全基因,利用分子克隆和定点突变技术构建表达优化促胰岛素(Optimized rolGLP-1,Opt-rolGLP-1)的大肠杆菌工程菌株,能保证各拷贝之间的无缝连接(无任何多余的氨基酸)。大肠杆菌工程菌株E.coli BL21(DE3)/Opt-rolGLP-1经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western Blotting结果证明实现了Opt-rolGLP-1在大肠杆菌的高效分泌表达,对其诱导表达条件进行优化,结果表明Opt-rolGLP-1的最佳表达条件为IPTG终浓度为1mM,25℃下培养8h。诱导后菌体经过超声破碎,采用阴离子交换层析和凝胶过滤层析,成功纯化出纯度高达98%的Opt-rolGLP-1,满足动物实验要求。Opt-rolGLP-1中每个拷贝rolGLP-1C端的最后一个氨基酸恰好是精氨酸(胰蛋白酶识别位点),体外酶切实验证明,Opt-rolGLP-1可被胰蛋白酶识别并切割成单拷贝rolGLP-1.通过对C57BL/6J小鼠进行高脂高糖饮食合并腹腔注射小剂量(mg/kg)链脲佐菌素,两次成功构造2型糖尿病小鼠模型,证明此造模方法成熟稳定。糖尿病小鼠经过灌胃Opt-rolGLP-1和单拷贝rolGLP-1或皮下注射单拷贝rolGLP-1治疗后,小鼠饮食饮水量有所下降,因高血糖导致的体重下降现象也被遏止,而且小鼠的糖化血红蛋白、胆固醇、甘油三酯含量明显下降,高胰岛素血症和口服糖耐量都得到有效改善。此外Opt-rolGLP-1和rolGLP-1能上调糖尿病小鼠肝脏GLUT2、INSR、GCK mRNA的表达水平,同时下调肝脏PGC-1α mRNA的表达量,这可能是Opt-rolGLP-1和rolGLP-1治疗糖尿病的重要分子机制之一。本研究亦考察了Opt-rolGLP-1对正常昆明小鼠饮食饮水及体重的影响,结果发现Opt-rolGLP-1可以降低正常昆明小鼠的摄食摄水量,延缓小鼠体重的增长,证明其保持了天然GLP-1抑制食欲,延迟胃排空的活性。本研究为口服多肽(蛋白)药物的开发提供了良好的实验依据和理论支持,同时也为Opt-rolGLP-1后期的临床实验和临床应用奠定基础。