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背景:肝纤维化是机体对于慢性肝损伤的一种修复性应答。目前公认的发病机制主要是在肝脏多种细胞及细胞因子(CK)参与下,引起细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡。TGFβ是目前己知最强烈的纤维化促进因子,可显著增加ECM合成并间接抑制其降解。它必须活化后与受体结合才能发挥作用。其中Ⅰ、Ⅱ型受体在传导TGFβ作用的信号通道中起主要作用,两者缺一不可。现已证明,肝纤维化时,一方面由于ECM产生增多,另一方面是因为调节ECM降解的基质金属蛋白酶(人为MMP-1,鼠为MMP-13)的活性被其主要特异性抑制剂TIMP-1所抑制,致使ECM的降解减少引起的。目前针对纤维化基因治疗主要集中在单独抑制TGFβRⅡ的表达以及单独抑制TIMP-1的表达。针对TβRⅡ型受体及TIMP-1联合反义治疗的研究国内外尚未见报道。本研究旨在构建反义TβRⅡ真核细胞表达质粒,并将其与反义TIMP-1真核细胞表达质粒联合导入大鼠肝纤维化模型中,观察外源质粒对实验性肝纤维化的影响,这可能有助于为将来临床慢性肝病肝纤维化的治疗提供新的有效途径。方法:查阅文献,采用两对套式引物,运用逆转录巢式PCR技术扩增TβRⅡ片段并经测序鉴定,双酶切纯化PCR产物及pcDNA3.1(+),再将TβRⅡ反向插入pcDNA3.1(+)线性质粒,即构建成反义TβRⅡ/pcDNA3.1(+)真核细胞表达质粒。将反义质粒转染感受态细胞JM-109,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及DNA测序分析。购得雌性SD大鼠90只,随机分为:正常对照组(15只),反义TβRⅡ+反义TIMP-1质粒组(15只)、反义TβRⅡ质粒组(15只)、反义TIMP-1质粒组(15只)、pcDNA3.1(+)空质粒对照组(15只)、肝纤维化对照组(15只)。实验中,除正常对照组外,其余以复合因素四氯化碳+饮用酒精+高脂高胆固醇饮食复制肝纤维化模型。各反义质粒组及空质粒对照组动物在模型制作两周后,每隔9天经腹腔给予脂质体包埋好的质粒100μg。最后一次CCl4攻击后2天宰杀实验动物,取动物肝组织。采用HE染色、VG染色观察肝组织病理形态学变化,应用免疫组化测定动物肝组织中Ⅰ型胶原、TβRⅡ、TIMP-1、MMP-13蛋白水平的表达。实验结果采用SPSS软件11.0作单因素方差分析,病理形态学观察结果作非参数检验。结果:反义TβRⅡ/ pcDNA3.1(+)真核细胞表达质粒构建成功;实验过程中空质粒组死亡率为7%,在正常范围;正常对照组、反义TβRⅡ+反义TIMP-1质粒组、反义TβRⅡ质粒组、反义TIMP-1质粒组、pcDNA3.1(+)空质粒组、肝纤维化组Ⅰ型胶原的蛋白表达的灰阶值分别为:170.450±5.694、154.410±4.877、144.984±2.629、146.008±5.630、133.470±3.932、134.547±4.750;正常对照组、反义TβRⅡ质粒组、空质粒组、肝纤维化组的TβRⅡ蛋白表达的灰阶值分别为:155.677±6.010、124.442±4.088、115.190±6.839、115.064±5.720;正常对照组、反义TIMP-1质粒组、空质粒组、肝纤维化组TIMP-1的蛋白表达的灰阶值分别为:135.791±3.546、114.661±5.285、95.356±5.113、