前期工作背景：在2004年,对恒河猴的cDNA文库进行筛选得到TRIM5α,一种能够抑制HIV-1感染的细胞质因子。恒河猴和短尾猴的TRIM5α能够抑制HIV-1感染而不能抑制SIVmac,与此相反,人的TRIM5α对上述病毒几乎没有什么抑制作用,具有能力抑制Y逆转录病毒N-MLV。然而,当有个别氨基酸改变时,人源的TRIM5α将具有和恒河猴TRIM5α相似水平的抗HIV-1功能。由于人抗异种动物的免疫应答反应的存在,异种蛋白在人体内往往被快速清除,其半衰期也较短,因此本实验室选择人源的TRIM5α(改构体)进行研究。以往关于TRIM5α的绝大多数研究,主要围绕在基因水平上进行的,例如,通过脂质体、病毒载体等结构将TRIM5α基因转运进入细胞使之大量表达,从而改变细胞的表型。在实际操作过程中,往往存在可操作性差,转运效率低,稳定性不好,生物毒性作用的缺点。所以本实验室前期已经构建出PTD-TRIM5α和TRIM5αH (R328-332)的大肠杆菌表达系统,但是其表达量不高。本实验室对PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)的穿膜效率、对靶细胞的细胞毒性和抗HIV-1的能力进行了研究,表明PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)在穿膜肽的作用下,能够进入细胞发挥生物学作用,对靶细胞也无毒性。虽然PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)是人源的,但是本实验室进行了几个氨基酸的置换,所以其安全性有必要进一步考察,尤其是对正常人体细胞的毒性作用。到目前为止,TRIM5α限制HIV-1的机制已越来越清楚,但是,人们对于TRIM5α限制HIV-1复制的作用机制尚不完全清楚,许多问题还没有解决,大多停留在推测的水平。本实验室已经得出它直接与HIV-1的核衣壳蛋白gag结合,但它是否会导致核衣壳的重新定位、修饰或降解?[1]TRIM5α是否包含有一个泛素连接酶的亚单位,或者一个相似作用的SUMO (small ubiquitin-related modifier)转移酶的亚基?逆转录过程本身被TRIM5α阻断,还是DNA合成后降解的结果?TRIM5α还可能与其他什么蛋白结合?研究目的：1.将课题组前期构建的重组质粒pET28a转化大肠菌株BL21(DE3)α从基因水平上和蛋白质水平上,确定重组基因PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)得到表达。2.通过对比本实验室构建的人TRIM5α嵌合体重组质粒在各种不同表达条件下的表达量,从而探索出目的蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件。3.天然人源的TRIM5α抗HIV-1的能力比较低,当突变的TRIM5αH(R328-332)[即I→M(328)、G→Q(330)、R→P(332)]基因用逆转录病毒载体转染细胞后,具有较好的抑制HIV-1的作用,本实验室进行了上述突变,所以其安全性有必要进一步考察。对靶细胞的细胞毒性,本研究进一步研究其对人体正常细胞的毒性。4.本实验室已经得出它直接与HIV-1的核衣壳蛋白gag结合,为深入了解TRIM5α的抗HIV-1的机制,运用共聚焦显微镜观察TRIM5α作用的亚细胞部位。5.确定TRIM5α的泛素化与其抗HIV-1的能力的关系。研究方法：1.在基因水平上应用酶切鉴定、PCR鉴定、基因测序,在蛋白水平上利用SDS-PAGE、Western-blotting、肽图指纹图谱鉴定,进行重组基因PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH (R328-332)表达的鉴定。2.运用SDS-PAGE电泳分析重组蛋白在不同温度、IPTG的浓度、诱导时长、诱导时期与培养基的表达量,分别找出各个因素的目的蛋白表达量最大的最适条件。3.应用台盼蓝排斥实验和SunBioTMAm-Blue检测比色法检测PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)的细胞毒性和对细胞增殖的影响。4.重组蛋白和细胞核分别用FITC和Hoechst荧光标记,在共聚焦显微镜观察下观察荧光的分布情况,从而确定重组蛋白作用的亚细胞结构部位。5.采用ELISA方法检测TRIM5的泛素化与其抗HIV-1的能力的关系。实验结果：1.在基因水平上和蛋白质水平上,都出现了目的条带或目标峰,确定重组基因PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH (R328-332)得到表达。2.通过分析比较,重组质粒在30℃、IPTG的诱导浓度为0.5mmol/L、诱导时长为8h、菌液的OD值为0.6以及在TB培养基上培养人TRIM5α嵌合体蛋白表达量达到最大。3.在细胞样品中加入重组蛋白,3T3细胞的存活率都在83%以上,所以重组蛋白是安全无毒性的。4.分析荧光染料的颜色可知,重组蛋白只限定在细胞质内,没有进入细胞核内。5.当重组蛋白PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)的浓度分别为100μg·ml-1、10μg-mL-1、1μg-mL-1、0.1μg-1、0.01μg-mL-1时,UBPL浓度的浓度分别为225.7pg·mL-1、160pg·mL-1、125.7 pg·mL-1、57.1 pg·mL-1、41.4 pg-mL"1和720 pg·mL-1、304.3 pg·mL-1、164.3 pg·mL-1、88.6 pg·mL-1、51.4 pg·mL-1。结论：1.在本实验室人员地努力下,成功地构建了表达重组蛋白PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)的大肠杆菌原核表达系统,并且本研究在基因水平和蛋白质水平上得到鉴定。2.对重组蛋白PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)的大肠杆菌原核表达系统的表达条件进行了优化,使得重组蛋白质得率有显著地提高。3.之前本实验室已经证明了重组蛋白PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)对靶细胞无毒性,本研究进一步证明了重组蛋白对人体正常细胞是安全无毒性作用。4.通过荧光标记,在共聚焦显微镜下观察重组蛋白PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH (R328-332)的抗HIV-1的作用限定在细胞质内,不进入细胞核,重组蛋白没有进入细胞核直接抑制HIV-1的复制,故可确定重组蛋白是通过阻碍HIV-1复制前的或复制后的生命活动过程,从而达到抗HIV-1的作用。5.通过ELISA法检测发现,重组蛋白PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH (R328-332)的泛素化作用与抗HIV-1能力呈一定地线性关系。由此可知,重组蛋白有可能是通过促进对特异性病毒蛋白质的水解,达到抗病毒作用。