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【目的】 1. 探讨低氘水对人黑色素瘤A375细胞的抑制作用及其对人角质形成细胞的影响。 2. 探讨低氘水对紫外损伤后的人角质形成细胞的保护作用。 3. 探讨低氘水对人黑色素瘤细胞的凋亡作用及相关分子机制。 【方法】 人黑色素瘤细胞(A375细胞)与人角质形成细胞(HaCaT细胞)分别用含有不同氘浓度的低氘水(25ppm、50ppm、100ppm)和普通水(150ppm)配成的高糖DMEM培养基培养。通过细胞增殖实验(CCK-8)和平板克隆形成实验比较低氘水对A375细胞和HaCaT细胞的增殖差异。划痕试验检测低氘水对A375细胞和HaCaT细胞伤痕愈合能力。CCK-8实验测定低氘水对紫外损伤的HaCaT细胞的细胞存活率。划痕实验检测不同浓度低氘水对紫外损伤的HaCaT细胞伤痕愈合的能力。多巴速率氧化法检测低氘水对A375细胞的酪氨酸酶活性的影响。Transwell小室实验用于A375细胞迁移能力的检测。DAPI染色观察A375细胞凋亡情况。流式细胞仪检测A375细胞凋亡和细胞周期分布。ATP酶测试盒检测低氘水对A375细胞ATP酶表达的变化差异。qRT-PCR检测A375细胞中bcl-2、bax和caspase-3 mRNA的表达量。Western blot检测A375细胞中bcl-2、bax、caspase家族通路和MAPK家族通路的凋亡蛋白表达水平。免疫荧光法观察低氘水作用前后cleaved caspase-3和p-p38在A375细胞中表达定位的改变。 【结果】 1. CCK-8实验:随着氘浓度的降低,A375细胞的抑制率逐渐增大,差异均有统计学意义(P<0.05),但对HaCat细胞增殖无抑制作用,还有轻微的促增长作用(P<0.05)。 2. 克隆形成实验:随着氘浓度的降低,A375细胞的克隆集落数明显减少(P<0.01),相反,HaCat细胞的克隆集落数逐渐增多(P<0.01)。 3. 伤口划痕试验:低氘水可抑制A375细胞划痕的愈合能力,相反,低氘水促进了HaCat划痕的愈合(P<0.01)。 4. HaCaT细胞紫外损伤模型构建:CCK-8实验检测发现随着UVB剂量的增加,HaCat细胞的抑制率逐渐上升,差异有统计学意义(P<0.01)。 5. CCK-8实验:随着培养基氘浓度的降低,紫外损伤后的HaCat细胞存活率逐渐上升(P<0.05)。 6. 紫外损伤伤口划痕试验:与对照组相比,低氘水显著促进了紫外损伤后的HaCat细胞划痕的愈合与修复(P<0.05)。 7. 多巴速率氧化法:低氘水对A375细胞的酪氨酸酶活性没有作用,差异无统计学意义。 8. Transwell实验:随着氘浓度的降低,穿过Transwell小室膜的A375细胞数逐渐减少,说明低氘水可抑制A375细胞的迁移。 9. DAPI染色:随着氘浓度的降低,A375细胞核裂解碎裂的更加明显且数量也逐渐增多。 10.细胞凋亡检测:流式细胞仪分析显示,细胞凋亡的数量随着氘浓度的降低而增加,说明低氘水可促进A375细胞的凋亡。 11.细胞周期分析:与对照组相比,实验组G1期细胞的比例增加(P<0.01),而其所处G2期细胞的比例下降(P<0.01),说明低氘水可以诱导细胞在G2期发生阻滞。 12. ATP酶活性检测:随着氘浓度的降低,A375细胞中Na+k+-ATPase、Ca2+Mg2+-ATPase及T-ATPase的活性逐渐降低(P<0.05)。 13. qRT-PCR:检测发现A375细胞中bcl-2和bax mRNA表达量呈相反趋势,而caspase-3 mRNA的表达量有所降低(P<0.05)。 14. Western-blot:低氘水在上调Bax的蛋白质水平的同时下调了Bcl-2的蛋白质水平,并且促进了caspase家族中凋亡标志物cleaved caspase-9/3和PARP蛋白的活化,在MAPK通路中,上调p38MAPK和JNK的磷酸化表达,下调Erk1/2磷酸化表达,并呈浓度依赖关系,差异具有统计学意义(P<0.05)。 15.免疫荧光法:低氘水作用前后cleaved caspase-3和p-p38在A375细胞中的定位表达情况,结果显示低氘水可诱导cleaved caspase-3和p-p38入核,且表达水平增强。 【结论】 1. 低氘水对A375细胞的增殖有抑制作用,但对HaCat细胞的增殖具有轻微的促进作用。 2. UVB辐射可抑制HaCat细胞增殖生长,但是低氘水可促使紫外损伤的HaCat细胞愈合,对HaCat细胞有保护作用。 3. 低氘水可抑制A375细胞增殖并诱导其凋亡,A375细胞凋亡可能与低氘水调控bcl-2/bax的比例,还有caspase家族和MAPK家族的蛋白表达有关。