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背景卡铂（carboplatin,CBP）虽然为肺癌一线化疗药物,但是其对人体全身毒副作用限制了临床应用。超声联合微泡（ultrasound combined with microbubbles,USMB）已广泛应用于增强药物递送及辅助化疗。然而不同肿瘤细胞对于超声的敏感性不同,超声与微泡的空化效应有一定的随机性,且各研究超声仪器、能量参数不同,目前尚未得出统一的标准,实验结果无法互相比较。因此,筛选出安全有效的卡铂剂量与声学参数,合理评估超声联合微泡介导药物递送的效果、探讨抑制细胞活性的作用机制等问题有待解决。细胞内钙离子浓度(intracellular calcium ion concentration,[Ca2+]i)是调节声孔动力学与细胞命运的双刃剑,在特定条件下可以诱发细胞凋亡,也可以促进细胞膜再封闭。Ca2+与超声空化介导药物递送的有效性与安全性有着密切的关系,因此,本研究提出假设:细胞内钙稳态在USMB联合卡铂化疗中对细胞生命结局起到关键作用,[Ca2+]i的改变是USMB联合卡铂化疗发挥生物学效应的可能机制。目的探讨超声联合微泡辅助卡铂抑制体外人肺癌A549细胞系活性的适宜的卡铂剂量及超声能量参数,评估超声联合微泡与卡铂治疗对于抑制A549细胞活性的效果。通过监测A549细胞[Ca2+]i,探讨超声联合微泡对A549细胞卡铂化疗微环境中Ca2+稳态的影响及其协同卡铂抑制细胞活性的可能机制。方法1.于96孔板接种A549细胞,加入浓度梯度为0300μg/ml的卡铂培养24 h,每孔加入10μlCCK-8溶液,避光孵育1.5 h,酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度值,计算细胞抑制率,应用Graphpad Prism 5软件的“药物剂量-效应模型”计算卡铂24h半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）,选择IC25（25%inhibitory concentration,IC25）作为卡铂的适宜剂量。2.设置对照组（无处理组）和实验组[超声辐照组（ultrasound,US）、超声联合微泡组（USMB）、卡铂组（CBP）、卡铂+超声组（CBP+US）、卡铂+超声联合微泡组（CBP+USMB）],声强梯度范围0.22.2W/cm2,频率1 MHz,占空比10%,辐照时间1 min,培养24 h,CCK-8法测细胞存活率。3.应用SPSS 24.0软件比较相同声强的US、USMB、对照组细胞存活率,相同声强的CBP+US、CBP+USMB、CBP组细胞存活率,CBP+USMB组内不同声强下细胞存活率,筛选安全有效的超声能量参数。4.光学倒置显微镜观察各组细胞形态学变化。5.按照是否使用微泡造影剂及卡铂的不同剂量设置AF组:超声辐照（US）组（A组）、超声联合微泡（USMB）组（B组）、低剂量CBP（100μg/ml）+US组（C组）、低剂量CBP+USMB组（D组）、高剂量CBP（200μg/ml）+US组（E组）、高剂量CBP+USMB组（F组）,经无Ca2+缓冲液HBSS（Hank’s Balanced Salt Solution,Hanks缓冲液）漂洗、负载钙离子荧光探针fluo-4 AM、再漂洗,激光共聚焦显微镜实时测定基态、加药中、加药后、超声辐照（0.4 W/cm2,10 s）后每组A549活细胞内Ca2+荧光强度。6.在每个视野内勾选细胞,绘制时间-标准化荧光强度曲线,总结组内、组间钙超载现象,并应用SPSS 24.0软件分析比较组间钙振荡幅度与钙超载总时长。结果1.卡铂24h IC50均数为65.72μg/ml,IC25约为50.00μg/ml,即为卡铂治疗24h的适宜剂量。2.当声强为0.6W/cm2时,US组、USMB组细胞存活率与对照组比较,差异无统计学意义（P=0.142）。同一声强（0.6、1.4、2.2W/cm2）的CBP+US、CBP+USMB组与CBP组细胞存活率两两比较差异均有统计学意义（均P<0.05）。不同声强（0.21.0W/cm2）的CBP+USMB组细胞存活率比较差异无统计学意义（P=0.691）。抑制A549细胞活性由强到弱排序为CBP+USMB组、CBP+US组、CBP组、USMB组及US组。3.镜下实验组A549细胞呈现不同程度的形态不规则、贴壁性降低,以CBP+USMB组为著。4.超声辐照后,细胞内Ca2+标准化荧光强度升高,达到极值,后回落至新稳态（A、B、E、F组勾选的全部细胞）或产生二次钙振荡（C、D组部分细胞）。B组勾选细胞钙振荡均有叠加,C、D两组部分细胞有叠加。A组4个细胞延迟发生钙振荡。D组钙超载时间最长。与A组比较,其余五组钙振荡幅度增加且差异有统计学意义（均P<0.05）。与A组比较,B、D组钙超载总时长增加且差异有统计学意义（均P<0.05）。结论1.卡铂50μg/ml、声强0.6W/cm2分别为24 h联合疗法的适宜剂量、超声能量参数。2.超声联合微泡可与卡铂协同抑制A549细胞活性。3.在无Ca2+细胞外液中,US、USMB、CBP+US、CBP+USMB均为A549细胞钙超载的直接刺激。SonoVue、CBP、CBP+SonoVue为超声辐照诱导A549细胞钙超载的增效刺激。US、USMB与卡铂可协同诱导A549细胞内源性钙释放,钙超载为超声联合微泡对卡铂化疗可能的增效机制。