论文部分内容阅读
肠道菌群对维持机体健康有重要作用,菌群失衡与腹泻密切相关,且仔猪腹泻可造成重大经济损失,但是对健康、腹泻仔猪间肠道菌群差异、腹泻潜在致病菌知之甚少。产气荚膜梭菌已被多次报道可导致仔猪腹泻,对其携带的毒素基因、健康与腹泻分离株克隆群的差异比较、肠道内菌数进一步了解,有利于提供防治Cp引起的疾病措施。乳酸杆菌作为众所周知的益生菌,具有多种益生功能和参与调节菌群平衡,筛选拮抗Cp的乳杆菌,对于预防仔猪腹泻有较大的应用前景。采集江西多个地区仔猪粪样,提取粪样总DNA,扩增16S rDNA的V3-V4区并测序,优化后的序列进行生信分析。健康、腹泻组OTU水平venn图比较可得知腹泻致病菌可能是机会致病菌。两组的α多样性指数差异不显著,功能预测结果显示各功能相对丰度仅存在差异。新生仔猪肠道菌群随机森林和LEfSe分析显示Fusobacterium mortiferum,unclassified Proteus,unclassified Tyzzerella,PrevorellaceaeUCG003和Alispes shahill是导致从健康到腹泻转变的关键微生物,其中Fusobacterium mortiferum在健康、腹泻组中相对丰度差异显著,可能与仔猪腹泻密切相关。梭菌属下的两个主要组的相对丰度有较大差异,Clostridium sensu stricto2在腹泻组丰度是在是健康组的4.5倍。依据健康/腹泻新生仔猪肠道菌群分析结果,对仔猪粪样中Clostridium perfringens（Cp）进行进一步的分离培养、检测粪样DNA主要Cp菌毒素基因,并利用荧光定量PCR定量粪便中Cp菌数。此外,对来自不同地区健康/腹泻新生仔猪分离的24株A型Cp（CpA）进行MLST分型分析,分离株提取DNA,扩增7条管家基因和α毒素基因并测序,使用获取的ST号进行构建进化树,通过比较菌株的等位基因序列的多态性,了解菌株基因组中的潜在突变。研究结果显示:江西地区仔猪粪便中CpA菌β2毒素均为阳性。α毒素基因在健康、腹泻仔猪的检测率分别为85.4%（41/48）、81.3%（39/48）,β2毒素基因则分别为79.2%（38/48）,77.1%（37/48）,健康仔猪均略高于腹泻仔猪。进化树结果说明猪源Cp携带的β2毒素基因有较高的保守性,仅有不多于3个碱基的突变,与GenBank登录号AJ537530.1对应序列同源性最高。荧光定量结果中Ct值差异不显著,则说明Cp菌数在健康、腹泻组可能差别不大。24株CpA MLST分型结果表明菌株具有遗传多样性特点且α毒素基因对于分型影响较小。来源于健康/腹泻仔猪的CpA总体遗传差异不大,但同一地区腹泻仔猪的CpA聚类明显高于健康仔猪CpA。依据微生态平衡理论,筛选CpA拮抗菌预防仔猪梭菌性肠炎。本试验从健康母猪粪样分离乳酸杆菌,并测产酸能力及耐胆盐能力。建立CpA与乳酸杆菌共培养系统,确定CpA在改良MRS培养基中的生长曲线及β2毒素表达时间。利用建立的共培养系统检测乳酸杆菌对Cp毒素基因表达的影响,筛选对Cp抑制效果良好且稳定的乳酸杆菌。成功分离Lactobacillus amylovorus和Lactobacillus reuteri。CpA培养6h后到达生长曲线稳定期,且仅检测到β2毒素基因表达。共培养结果显示Lactobacillus reuteri对β2毒素基因表达有较好的抑制效果。本研究通过细菌16SrDNA高通量测序分析了同一窝新生仔猪中健康/腹泻肠道菌群差异,针对引起新生仔猪腹泻的菌进一步分析。对来源于健康/腹泻新生仔猪CpA进行MLST分型,进一步确定健康、腹泻CpA分离株差异及遗传多样性。以CpA及其所携带β2毒素基因作为研究对象,筛选得到益生乳酸杆菌Lactobacillus reuteri,能有效抑制CpA增殖和β2素素基因表达,有很大潜力被开发为用于防治仔猪梭菌性肠炎的微生态制剂。