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[目的]miRNA在调控肿瘤细胞生物行为中起着重要作用,本课题的目的是考察miRNA-99b-5p(miR-99b-5p)与肺癌患者生存期间的相关性,同时研究其对肺癌增殖,侵袭和转移能力的影响并探索其作用靶点及机制。[方法]1.TCGA数据库(starBase v3.0 project)分析miR-99b-5p在肺癌组织和正常组织间转录差异,及其转录水平与肺癌患者生存间的相关性;2.在肺癌细胞株中验证miR-99b-5p的功能机制:借助细胞转染的方法,过表达miR-99b-5p后,分别用CCK-8法,细胞划痕实验和细胞迁移侵袭实验(Transwell)技术研究miR-99b-5p对肺癌细胞增殖率,侵袭能力和迁移能力的影响;3.双荧光素酶报告基因检测和蛋白质印迹法Western blot研究和验证miR-99b-5p的作用靶点及功能机制。[结果]对比肺正常组织,miR-99b-5p在肺癌组织标本中低表达;miR-99b-5p高转录肺癌患者较miR-99b-5p低转录患者具有较高的生存率,p=0.02;miR-99b-5p在非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H292中的转录水平显著低于人支气管上皮细胞株16-HBE(p<0.001);miR-99b-5p在小细胞肺癌株NCI-H69的转录水平低于人支气管上皮细胞株16-HBE(p<0.05);miR-99b-5p在人胚肾细胞株HEK293T的转录水平较人支气管上皮细胞株16-HBE无显著差异(p=ns);上调miR-99b-5p转录水平可抑制肺癌细胞的增殖,侵袭和转移能力,p<0.01;FZD8是miR-99b-5p的结合靶点;过表达FZD8可部分逆转miR-99b-5p对肺癌细胞增殖,侵袭和转移行为的抑制作用,p<0.01。[结论]miR-99b-5p通过靶向FZD8抑制肺癌细胞的增殖,侵袭和转移,与肺癌患者的生存显著相关,这种新鉴定的miR-99b-5p/FZD8轴提供了对肺癌进展机制的新见解。[目的]1、筛选化合物GA13315抑制肺癌细胞的相关作用靶点,挖掘相关信号转导通路,了解关键分子靶标间的互作关系,诠释化合物的潜在抑瘤途径,验证关键靶点的正确性,给进一步深入研究化合物作用机制提供方向;2、验证化合物GA13315对肺癌细胞的部分作用机制,为研究有效,低毒,经济的新型抗癌药物奠定基础。[方法]1、梯度浓度化合物GA13315作用于肺癌细胞株A549和H460 48小时,CCK-8法检测肺癌细胞增殖率;转录组测序技术检测化合物作用于肺癌细胞前后的差异表达基因谱,行基因本体(Gene Ontology)功能聚集分析,KEGG通路分析,基因互作网络分析。基于Foldchange和P值,结合生物信息结果,筛选10个目的基因,用qPCR方法验证其准确性,挖掘化合物GA13315对肺癌细胞细胞的潜在作用机制。2、过表达和沉默目的基因,验证化合物GA13315促肺癌细胞凋亡的相关信号转导通路及靶点,染色质免疫共沉淀方法检验与目的基因结合的转录因子。使用SPSS 19.0软件(SPSS Inc.)分析数据,并表示为平均值±标准差的形式。通过Student’s t-tests评估两组之间的差异显著性。通过方差分析分析多组之间的差异,而后用 Tukey’s honestly signifcant difference post-hoc test 评估各组间的差异。p<0.05被认为统计学上有显著差异。[结果]1、化合物GA13315对肺癌细胞有显著抑制增殖和促进凋亡作用,IC50=11.37±2.23μM。化合物GA13315作用肺癌细胞后共有250个差异表达基因(FC≥1.5;P<0.05),其中94个基因表达上调,156个基因表达下调,qPCR和western blot方式验证发现,TRIM67,NF-κB2,FAS在化合物作用后均出现上调。2、沉默TRIM67的表达后,化合物GA13315促肺癌细胞的凋亡作用下降。3、TRIM67促进NF-κB2由前体蛋白转化为活性蛋白p52,激活NF-κB2信号转导通路,上调FAS蛋白表达,促进肺癌细胞的凋亡。[结论]化合物GA13315对肺癌细胞有显著的抑制增殖作用和促凋亡作用;化合物GA13315作用于肺癌细胞后出现众多显著差异基因;其中TRIM67在化合物GA13315促肺癌细胞凋亡作用中起着关键作用,TRIM67促进NF-κB2由前体蛋白转化为活体形式p52,激活NF-κB2信号转导通路,上调FAS蛋白表达,促进肺癌细胞的凋亡。