论文部分内容阅读
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在全球居于第3位,在我国居于第2位[1-2],其临床特征是生长快,易转移,预后极差。研究表明,肿瘤的生长和转移并不是一个孤立的过程,而是建立在肿瘤细胞与周围微环境及机体内环境之间相互作用的基础之上。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作为微环境细胞成分和结缔组织的干细胞,成为近年来的研究热点。MSCs是来源于中胚层的一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的非造血干细胞,主要存在于全身结缔组织、器官间质和骨髓组织中[3]。据目前报道来看,MSCs对肿瘤的增殖和转移具有促进或是抑制作用尚存在争议[4-17]。本实验室应用骨髓MSCs与人低转移肝癌细胞株HepG2融合,证明融合后的细胞侵袭、迁移能力均增强[18]。基于上述研究背景和本实验室研究基础,本文拟观察大鼠MSCs对人肝癌细胞株HepG2、 SMMC-7721增殖和转移的影响,并对其分子机制进行初步探讨,为进一步研究MSCs在肝癌发生发展中的作用提供理论依据,有助于发现抗肿瘤生长和转移的治疗的新靶点。目的1.观察大鼠骨髓MSCs对人肝癌细胞在体内、外增殖和转移的影响。2.初步探讨大鼠骨髓MSCs对人肝癌细胞增殖和转移影响的的分子机制。研究方法1.大鼠MSCs的培养、鉴定采用全骨髓直接贴壁法获得原代大鼠MSCs,差速贴壁结合消化控制法纯化细胞,镜下观察细胞形态,流式细胞术检测第5代MSCs的细胞表面标志CD90、CD105、CD34、CD45的表达；分别取第1、4、8代MSCs测定细胞增殖能力,绘制生长曲线；收集MSCs培养上清备用。2.大鼠MSCs对肝癌细胞增殖的影响及分子机制MTT法检测MSCs对肝癌细胞HepG2增殖能力的影响；平板克隆试验、软琼脂克隆形成试验检测单个肿瘤细胞空间克隆形成能力；流式细胞术检测细胞周期变化；Western blot检测MSCs对肝癌细胞HepG2Cyclin D1蛋白表达的影响。3.MSCs对肝癌细胞转移的影响及分子机制划痕实验、细胞侵袭、迁移实验观察体外MSCs对肝癌细胞SMMC-7721侵袭、迁移能力的影响；收集SMMC-7721、MSCs,分别与Matrigel混匀,注射至BALB/c裸鼠肝脏,建立肝脏原位肿瘤模型,观察体内MSCs对肝癌细胞SMMC-7721转移能力的影响。探讨MSCs促进肝癌细胞转移的分子机制,ELISA试剂盒检测MSCs上清中TGF-β的含量；Western blot法检测SMMC-7721细胞株上皮-间质转变(EMT)标志性蛋白E-cadherin和Vimentin的表达,EMT主要调节因子Twist1和Snail的表达；半定量RT-PCR法检测Twist1和Snail基因mRNA水平的改变；明胶酶谱法检测在MSCs上清作用后SMMC-7721细胞MMP2和MMP9表达水平的改变。研究结果1.经骨髓分离培养所得到的细胞,通过流式细胞仪检测细胞表面标志物CD90(+), CD105(+), CD34(-), CD45(-),符合国际MSCs特征。生长曲线表明MSCs第1、4代增殖能力较强,第8代MSCs增殖能力减弱。2.在骨髓MSCs培养上清作用条件下,MTT法显示实验组肝癌细胞株HepG2的OD值增加(P<0.05),平板克隆法显示实验组肝癌细胞克隆形成率分别为37.89%±2.7%、46.57±1.1%、53.88%+3.0%和52.51%±1.5%,比对照组28.34%±1.2%明显升高(P<0.05),软琼脂克隆法显示实验组肝癌细胞空间克隆形成率分别为18.92%±2.21%、27.22%±1.15%、28.21%±2.11%和27.12%±1.53%,比对照组11.27%±2.12%明显升高(P<0.05),流式细胞术显示实验组细胞周期G1期比例降低,S期比例增加,G2期增加。Western blot显示细胞Cyclin D1表达量增加。3.在骨髓MSCs培养上清作用条件下,细胞迁移实验结果表明,实验组迁移细胞数分别为359.04±42.43、519.8±25.28、489.68±33.44,比对照组212.36±28.91明显增加(P<0.05)；细胞侵袭实验结果表明,实验组侵袭细胞数分别为21.96±2.04、41.46±3.79、69.08±6.03,比对照组10.24+1.88明显增加(P<0.05)。建立肝脏原位肿瘤模型,结果显示,混合细胞组肝内转移灶平均数目为4.42±1.39,SMMC-7721组肝内转移灶平均数目为2.42±0.97,两组比较有统计学差异(P<0.05)。混合细胞组肝癌肺转移发生率为85.71%,而SMMC-7721组仅为28.57%,两组相比有统计学差异。MSCs组肝脏、肺脏未见肿瘤形成。ELISA试剂盒检测MSCs细胞24h培养上清TGF-β1含量为0.508±0.027pg/ml。MSC-CM作用后,明胶酶谱实验结果证实,肝癌细胞SMMC-7721中MMP2和MMP9表达的水平均增高；Western blot检测EMT标志性蛋白E-cadherin和Vimentin的表达,结果表明E-cadherin表达降低,而Vimentin表达明显升高；进一步检测EMT调节因子Twistl和Snail表达,发现SMMC-7721细胞中Twistl和Snail表达均增强；RT-PCR检测[wist1和Snail的mRNA表达水平与Western blot检测结果一致。结论1. MSCs可增强肝癌细胞HepG2的增殖能力,并可提高肝癌细胞株SMMC-7721的侵袭、迁移的能力和在体内的转移能力。2. MSCs可上调肝癌细胞HepG2中Cyclin D1的表达,提示促进细胞周期,增强增殖能力。MSCs分泌TGF-p,上调EMT调节因子Snail、Twist的表达使肝癌细胞SMMC-7721细胞发生EMT转变,同时上调MMP2和MMP9的表达,二者的共同作用可能是MSCs促进肝癌细胞侵袭、转移能力增强的机制。