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背景及目的:炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是由免疫介导的肠道疾病,包括溃疡性结肠炎、克罗恩病和未定型结肠炎。IBD已成为全球性疾病,在西方国家IBD发病率稳定,而新兴工业国家的IBD发病率则不断上升。据中国疾病预防中心数据显示,中国2005-2014年间IBD总病例约为35万,而另一项国际研究预测,到2025年,中国的IBD患者将达到150万。研究表明,IBD患者肠道菌群失衡,产丁酸菌丰度显著降低。丁酸可参与肠上皮细胞供能,且丁酸具有抗炎、免疫调节作用,可保护肠粘膜屏障。丁酸梭菌(Clostridium butyricum,CB)是一种以丁酸为主要产物的益生菌,具有改善结肠炎、减少细胞凋亡、保护肠道屏障功能和维持肠道平衡等作用。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种跨膜蛋白。EGFR活化可促进结肠炎受损粘膜恢复,EGFR缺陷可致结肠炎易感性增加。本研究旨在探讨CB通过活化EGFR缓解结肠炎的作用机制。研究方法:丁酸梭菌上清液(Clostridium butyricum supernatant,CBS)刺激人结肠细胞系(Caco-2),蛋白质印迹法检测不同浓度和时间刺激下EGFR的活化情况。CBS预处理Caco-2细胞系,加入EGFR抑制剂(AG1478),双氧水诱导细胞紧密连接破坏,免疫细胞化学染色法检测细胞紧密连接完整度。8周龄雌性C57BL/6小鼠给予2%葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)连续5天以诱导结肠炎。DSS处理前5天及处理期间,小鼠每日灌胃一次CB或热灭活丁酸梭菌(heat-killed Clostridium butyricum,HK-CB)。每日监测小鼠体重及大便性状;测量小鼠结肠长度和肝脾重量;H&E染色评价结肠炎症情况;TUNEL法检测小鼠结肠细胞凋亡;免疫组化法评价结肠黏蛋白(MUC2)表达;PAS染色法评价杯状细胞数目;免疫荧光法评价结肠紧密连接蛋白(ZO-1)表达;实时荧光定量PCR检测结肠组织中炎症因子和肠屏障相关蛋白m RNA相对表达量;蛋白质印迹法检测结肠组织中肠屏障相关的蛋白和EGFR的表达量;气相色谱法测定小鼠回盲部粪便短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)含量。研究结果:1.气相色谱法测定CBS中SCFAs含量。CBS总SCFAs含量为400.17mg/L。其中,丁酸含量最高,其次是乙酸,丙酸和戊酸含量较低。2.CBS刺激浓度一定时,随着刺激时间延长,Caco-2细胞p-EGFR表达逐渐升高;CBS刺激时间一定时,随着刺激浓度增高,Caco-2细胞p-EGFR表达亦逐渐升高。3.双氧水处理可诱导Caco-2细胞紧密连接(ZO-1)破坏;用1/4浓度CBS预处理细胞4h,可减轻细胞紧密连接破坏;而抑制EGFR可减弱CBS对细胞紧密连接的保护作用。4.CB组小鼠在DSS处理后第5天,体重显著高于HK-CB组(94.52±0.96%vs 89.03±2.30%,P<0.05)。CB组小鼠疾病活动度评分在DSS处理后第3、4、5天显著低于HK-CB组(0.40±0.16分vs 0.87±0.16分,1.47±0.27分vs 2.27±0.24分,2.27±0.16分vs 3.07±0.18分,P均<0.05)。CB组小鼠结肠长度显著优于HK-CB组(6.09±0.22cm vs 5.45±0.22cm,P<0.05)。CB组小鼠结肠组织炎症损伤评分明显低于HK-CB组(8.00±0.75分vs 10.10±0.53分,P<0.05)。CB组小鼠回盲部粪便短链脂肪酸总含量及分别含量(乙酸、丙酸、丁酸和戊酸)均显著高于HK-CB组(658.30±48.88μmol/g vs 477.0±28.86μmol/g,613.10±48.66μmol/g vs 451.30±19.57μmol/g,4.99±0.20μmol/g vs 3.38±0.50μmol/g,2.94±0.17μmol/g vs2.21±0.23μmol/g,0.44±0.02μmol/g vs 0.35±0.03μmol/g,P均<0.05)。5.CB组小鼠凋亡细胞百分比显著低于HK-CB组(2.61±0.32%vs5.08±0.26%,P<0.001)。CB组小鼠结肠组织中促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和KC)m RNA相对表达水平较HK-CB组显著下降,抑炎因子(IL-10)m RNA相对表达水平较HK-CB组显著升高。6.免疫荧光染色结果示,CB组小鼠结肠ZO-1膜定位表达高于HK-CB组。蛋白质印迹结果示,CB组小鼠结肠组织中紧密连接蛋白(ZO-1和Claudin3)表达高于HK-CB组。CB组小鼠结肠组织紧密连接蛋白(ZO-1、Claudin3和Oclaudin)m RNA相对表达水平较HK-CB组显著升高。7.PAS染色示,CB组小鼠每个结肠隐窝中杯状细胞数显著高于HK-CB组(13.46±0.56个vs 9.21±0.53个,P<0.001);免疫组化结果示,CB组小鼠每个结肠隐窝中MUC2阳性细胞数显著高于HK-CB组(7.43±0.49个vs 5.39±0.61个,P<0.05)。8.蛋白质印迹检测结果示,CB组小鼠结肠组织中p-EGFR表达高于HK-CB组。研究结论:CB可活化结肠上皮EGFR,减轻肠屏障的破坏,改善DSS诱导的小鼠实验性结肠炎。本研究发现早期服用益生菌可改善IBD引起的症状,明确了益生菌作为IBD预防策略的潜在疗效机制,为今后进一步研究提供理论基础。