我们采取初情期的内蒙古白猪卵巢,用胶原酶对皮质组织消化处理,制备卵巢皮质组织单细胞悬液,再通过差速贴壁和抗体-磁珠分选法结合的方法富集卵原干细胞。在本实验中,我们采用的分选靶蛋白为Fragilis,最后将富含卵原干细胞的细胞悬液置于含有血清、EGF、BFGF、LIF的培养液中,在38.5℃、5%CO2的环境下培养,并对获得的卵原干细胞进行生物学特性验证。在培养5-7天后,出现卵原干细胞克隆,以后每隔2-3天传代一次,现在该细胞系在体外已经传代56代,猪卵原干细胞的克隆细胞与小鼠卵原干细胞的形态相似,细胞界限清晰,核质比大,体外传代次数超过6代后,小部分的卵原干细胞开始自发分化,细胞的体积增大,其直径可达60μm,形成卵母细胞样细胞,并且在卵母细胞样细胞外周形成透明带样结构,免疫荧光分析显示该结构与ZP3蛋白的抗体特异结合,免疫荧光染色显示这类细胞表达Scp3蛋白,表明这些卵母细胞样细胞处于减数分裂期。经免疫荧光检测、RT-PCR基因表达分析结果显示猪卵原干细胞表达Oct4、DDX4、C-kit、Nanog、Stella、Ifitm3、Blimp1等干细胞标记基因。核型分析显示我们建立的猪卵原干细胞系含有38条染色体,其中2条为XX性染色体。以上结果表明该细胞系具有卵原干细胞的全部特性,证明我们在体外成功构建了猪卵原干细胞系。