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目的:胰腺癌是一种致死率极高的恶性肿瘤，预后极差，疾病进展迅速，缺乏临床症状特异性，总体5年生存率不足5％。其原因在于胰腺癌细胞不仅增殖迅速，更重要的是有极强的侵袭及转移能力。手术仍然是胰腺癌的主要治疗方法，然而近80％左右的病人在明确诊断后已经有远处转移或者不可切除的局部转移而失去了手术适应症。其预后差的原因在于术后局部复发和远处转移。因此，对胰腺癌细胞侵袭转移机制的研究成为重中之重。然而至今其侵袭转移机制仍未完全阐明。 在恶性肿瘤中，蛋白质翻译后修饰的生化过程对细胞功能调控起到重要作用，至今其作用机制未完全明确。蛋白质磷酸化为其翻译后修饰的一种方式。因此明确肿瘤细胞磷酸化对其生物学功能调控的作用具有重要意义。在我们的先前研究中，针对同源性胰腺癌细胞（高侵袭转移性质的PC-1.0和低侵袭转移性质的PC-1），我们利用磷酸化蛋白芯片技术筛选这两种细胞中表达具有差异的蛋白及磷酸化位点，并对其中452个蛋白的582个磷酸化位点进行比对，其中RAF-1在Tyr-341位点上PC-1.0和PC-1细胞中磷酸化水平之比为2.68。这一结果表明RAF-1可能有调控胰腺癌的侵袭转移的作用。 RAF-1，又称C-RAF，是一种原癌基因，据文献报道，RAF-1在乳腺癌、结直肠肿瘤、非小细胞肺癌等肿瘤中表达量上调。RAF-1蛋白为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，连接上游RAS蛋白及下游MEK1/2，调控MAPK级联反应。它决定细胞多种过程包括增殖、分化、凋亡、存活以及致癌性转化。通过一系列的磷酸化，RAF-1的活化导致MEK-1和MEK-2（MAP2K1/MEK1和MAP2K2/MEK2）激活，进而激活ERK1/2，最终激活MAPK信号转导通路。而另一种蛋白AKT，同样由通过磷酸化蛋白芯片技术筛选出来，在Ser124位点上个PC-1.0和PC-1细胞中磷酸化水平之比为0.37.AKT为另一条信号转导通路PI3K-PTEN-AKT的一员，调控与RAF-1相似的生物学过程。 PI3K/PTEN/Akt和MAPK信号转导通路是现今公认的胰腺癌中的活化通路。这些通路具有调控细胞增殖，衰老和凋亡的作用。并使细胞具有耐药性。MAPK信号转导通路是细胞外信号传递入核的重要通路，并具有高度保守性。该通路能将基因信息传递入核，并调节细胞增殖、分化、凋亡、基因表达和细胞对外界环境反应。而RAF-1是两条信号转导通路的交汇点。所以我们提出假设:RAF-1可能是一个非常重要的靶点，对调控胰腺癌侵袭转移起重要作用。将成为胰腺癌早期诊断、预防及治疗局部复发及远处转移的新方法。 本研究利用RAF-1体外选择性抑制剂GW5074作用于高侵袭性细胞系PC-1.0及与其生物学功能相似的人类胰腺癌细胞Aspc-1，观察经抑制剂作用前后各细胞系在增殖，侵袭和转移方面的变化。以明确RAF-1在胰腺癌细胞中的分子生物学作用。并进一步探究RAF-1作为两条通路交点蛋白其上下游相互作用关系，以明确其在胰腺癌侵袭转移过程中的具体作用。从而为胰腺癌侵袭转移的早期诊断和临床治疗寻找新靶点。 方法: 一、实验材料 仓鼠胰腺癌细胞株PC-1和PC-1.0以及人类胰腺癌细胞Aspc-1和Capan-2获赠于日本熊本大学。 二、主要研究方法 1、蛋白表达情况检测:用western blot检测RAF-1、MEK1和MEK2的总蛋白及磷酸化蛋白表达情况。 2、体外侵袭实验:用Transwell实验检测RAF-1或AKT抑制剂干预前后的侵袭能力变化。 3、体外迁移试验:用Wound healing实验检测RAF-1或AKT抑制剂干预前后的迁移能力变化。 4、细胞增殖实验:用CCK-8细胞增殖实验检测RAF-1或AKT抑制剂干预前后的细胞增殖变化。 5、统计学处理:每次实验独立重复3次，采用spss13.0统计软件包对数据进行统计分析，结果以平均值士标准误(S EM)表示，两组间数据分析以Students t检验或方差分析表示，以P＜0.05认为具有统计学意义。 结果: 1、我们用与PC-1和PC-1.0生物学功能性相似的人类胰腺癌细胞Aspc-1和Capan-2进行验证，以明确仓鼠胰腺癌细胞实验结果是否与人类胰腺癌细胞一致，实验结果表明仓鼠胰腺癌细胞和人类胰腺癌并无显著差异，说明仓鼠胰腺癌细胞实验结果在人类胰腺癌细胞中同样适用。2、抑制RAF-1后，RAF-1、MEK-1/MEK-2总蛋白及磷酸化蛋白水平下调。3、抑制AKT后，RAF-1、MEK-1/MEK-2总蛋白及磷酸化蛋白水平上调。4、抑制RAF-1或AKT后，胰腺癌细胞侵袭功能受到抑制。5、抑制RAF-1或AKT后，胰腺癌细胞迁移功能受到抑制。6、抑制RAF-1或AKT后，胰腺癌细胞增殖功能受到抑制。 结论: 1.RAF-1由磷酸化蛋白芯片筛选得出，并与胰腺癌侵袭转移密切相关。 2.RAF-1蛋白表达水平和磷酸化水平下调可抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移，并且该功能是通过靶向MAPK中重要蛋白MEK1/MEK2作用完成的;AKT对RAF-1具有负向调控作用。 3.抑制AKT可抑制胰腺癌细胞的侵袭、转移及增殖能力。 4.RAF-1蛋白可成为治疗胰腺癌局部侵袭、远处转移的新靶点。