论文部分内容阅读
1目的:桦褐孔菌（Chaga）是一种药食两用真菌,主要分布在北半球40°-50°N的国家和地区。在我国,桦褐孔菌主要分布在东北地区,如黑龙江省。2016年,在山西吕梁山也确定了桦褐孔菌的分布区域。文献研究显示,桦褐孔菌在癌症和糖尿病的治疗中可以发挥重要作用,其中多糖及多酚（如山奈酚）为主要活性成分。桦褐孔菌多糖在发挥抗肿瘤和抗糖尿病作用时,对肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α、白介素（interleukin,IL）-1β等炎症因子的产生具有双向调节作用。项目组前期研究显示,静止状态的巨噬细胞（M0型）极化至经典活化型（classial activated macrophage,M1）时,TNF-α和IL-1β的产生会增加。而M0极化至替代活化型（alternatively activated macrophage,M2）时,TNF-α 和 IL-1β 的产生会减少。基于文献研究和前期工作,本研究首先利用水提醇沉法对山西产桦褐孔菌粗多糖（Chaga crude polysaccharide,CCP）进行了提取。然后利用 RAW264.7 小鼠巨噬细胞,我们研究了 CCP对M0型和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的M1型巨噬细胞产生一氧化氮（nitric oxide,NO）、TNF-α和IL-1β的影响作用。试图通过巨噬细胞极化探索CPP对炎症因子的影响,证明桦褐孔菌多糖对处于稳态/病理状态的巨噬细胞具有双向调节作用。2方法:2.1桦褐孔菌治疗不同疾病的文献分析利用 PubMed、Scopus、中国知网（China National Knowledge Infrastructure,CNKI）和万方数据库,我们检索了桦褐孔菌及其主要活性物质治疗8种疾病（包括糖尿病、癌症、心血管疾病、高血压、慢性炎症、神经退行性疾病、动脉粥样硬化和慢性肾脏病）的研究进展,检索时间为2002年1月1日至2021年12月31日。根据制定的纳入和排除标准,我们对桦褐孔菌及其多糖和多酚主要治疗的疾病进行了分析。根据分析结果,对桦褐孔菌多糖经炎症相关通路治疗癌症和糖尿病的机制进行了进一步的归纳总结。2.2 CCP的提取及含量测定取桦褐孔菌粗颗粒1.0kg,以料液比1:10加入蒸馏水浸泡,水蒸气加热提取,收集三次的提取液,合并后减压浓缩至相对密度为1.1,冷却至室温。在提取液中加入95%乙醇,边加边搅拌,至乙醇浓度为80%（V/V）,在4℃条件下冷藏静置过夜。收集沉淀部分,干燥至恒重,即得CCP。利用苯酚-硫酸法测定提取物中多糖的含量,利用紫外可见分光光度法测定提取物中山奈酚的含量。2.3 CCP对M0型巨噬细胞产生NO、TNF-α及IL-1β的作用（1）CCK-8法确定CCP对M0型RAW264.7小鼠巨噬细胞的安全作用浓度。（2）以DMEM培养液为正常对照,CCP作用于M0型巨噬细胞24 h后,Western Blot测定M1型极化标志物IL-1β和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）、M2型极化标志物甘露糖受体（mannose receptor 1,CD206）和精氨酸酶-1（arginase 1,Arg-1）的蛋白表达。（3）Griess法检测不同组别NO含量,Elisa法检测不同组别TNF-α和IL-1β含量。2.4 CCP对M1型巨噬细胞产生NO、TNF-α及IL-1β的作用（1）建立LPS诱导M0型巨噬细胞极化至M1型的体外模型。（2）CCK-8法确定CCP对M1型巨噬细胞的安全作用浓度。（3）以DMEM培养液为正常对照,LPS为模型对照,不同浓度CCP干预M1型巨噬细胞24 h后,Western Blot测定IL-1β,iNOS,CD206及Arg-1的蛋白表达。同样以Griess法检测NO含量,Elisa法检测TNF-α 和 IL-1β 含量。3结果:3.1桦褐孔菌治疗不同疾病的文献分析通过对桦褐孔菌治疗不同疾病的文献进行归纳分析。结果显示,桦褐孔菌治疗癌症的相关研究最多,占到了文献总数59.0%,其次是桦褐孔菌治疗糖尿病的研究,占到了文献总数的35.0%。桦褐孔菌的活性成分研究中,以多糖的研究居首。对桦褐孔菌多糖治疗不同疾病的文献进行分析的研究结果显示,多糖治疗癌症的研究最多,占到了文献总数的50.0%,其次是治疗糖尿病的研究,占到了文献总数的41.6%。3.2桦褐孔菌多糖治疗癌症及糖尿病的机制研究基于炎症相关信号通路,桦褐孔菌多糖治疗癌症的机制包括:免疫激活、NLRP3炎症小体激活、Akt/mTOR、MAPKs、NF-κB等信号通路。桦褐孔菌多糖治疗糖尿病的机制包括:氧化应激、NF-κB信号通路、NF-κB/TGF-β信号通路、PI3K/Akt信号通路、MAPK/NF-κB信号通路、及PPARγ信号通路。3.3 CCP的提取及含量测定利用水提醇沉法,1.0 kg的桦褐孔菌共获得112.5 g粗多糖提取物,提取率约为11.3%。CCP中多糖的含量为13.7%,即100 g的CCP中含有13.7 g多糖。山奈酚含量为1.9%,即100 g的CCP中含有1.9 g山奈酚。3.4 CCP对M0型巨噬细胞产生NO、TNF-α及IL-1β的作用（1）CCP作用于M0型巨噬细胞的安全浓度为25-200 μg/mL。（2）与正常对照组相比,CCP可以显著增加M1型极化标志物iNOS、IL-1β的蛋白表达（P＜0.05）,显著降低M2型极化标志物Arg-1、CD206的蛋白表达（P＜0.05）。与正常对照组（2.7±0.6）μM 相比,50 μg/mL、100 μg/mL 和 200 μg/mL CCP 均显著增加了NO（（9.3±3.2）μM,（14.2±3.5）μM,（18.6±2.1）μM）的生成（P＜0.05）。与正常对照组（452.9±36.3）pg/mL 相比,100 μg/mL 和 200 μg/mL CCP 显著增加了TNF-α（（570.5±21.0）pg/mL,（606.5±86.1）pg/mL）的生成（P＜0.05）。3.5 CCP对M1型巨噬细胞产生NO、TNF-α及IL-1β的作用（1）0.25 μg/mL的LPS可诱导M0型巨噬细胞向M1型极化。（2）CCP作用于M1型巨噬细胞的安全浓度为25-200 μg/mL。（3）与正常对照组相比,LPS模型组iNOS、IL-1β的蛋白表达显著增加（P＜0.05）,Arg-1、CD206的蛋白表达显著降低（P＜0.05）。与LPS模型组相比,CCP能显著降低iNOS和IL-1β的蛋白表达（P＜0.05）,显著增加Arg-1和CD206的蛋白表达（P＜0.05）。（4）与正常对照组（2.7±0.6）μM相比,LPS组的NO（（86.9±0.9）μM）含量显著增加,与模型对照组相比,25 μg/mL、50μg/mL、100μg/mL 和 200μg/mL CCP 均显著降低了 NO（（71.1 ±1.0）μM,（69.0±0.6）μM,（63.0±3.7）μM,（58.7±5.1）μM）的水平（P＜0.05）。（5）与正常对照组（452.9±36.3）pg/mL相比,LPS模型对照组的TNF-α（（522.2±45.7）pg/mL）含量显著增加,与模型对照组相比,200 μg/mL CCP显著降低了 TNF-α（（350.8±6.9）pg/mL）的水平（P＜0.05）。（6）与正常对照组（90.7±6.7）pg/mL相比,LPS组的IL-1β（（146.2±7.9）pg/mL）含量显著增加,与LPS组相比,100μg/mL 和 200 μg/mL CCP 显著降低了 IL-1β（（109.5±9.2）pg/mL,（114.0±10.0）pg/mL）的水平（P＜0.05）。4结论:（1）文献分析研究显示,桦褐孔菌活性成分中以多糖的研究最多。多糖治疗的疾病中,以癌症居首,其次为糖尿病。基于炎症相关信号通路分析,发现桦褐孔菌在治疗癌症和糖尿病时,对TNF-α和IL-1β等炎症因子具有双向调节的作用。（2）体外研究显示,CCP作用于M0型巨噬细胞,可以增加M1型标志物的表达,如NO、TNF-α和IL-1β。当LPS诱导M0极化至M1型后,CCP显著抑制M1型、增加M2型极化。（3）CCP对M0/M1型巨噬细胞的不同作用,使其对NO、TNF-α和IL-1β的产生表现出双向调节作用。（4）桦褐孔菌多糖对癌症、糖尿病具有的治疗作用,可能与其调节巨噬细胞分型,双向调节NO、TNF-α和IL-1β的作用相关。进一步研究桦褐孔菌多糖经巨噬细胞分型治疗癌症及糖尿病的体内作用,具有一定的研究意义。