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第一部分CREBH在肝细胞脂质过载模型中对自噬流的影响
目的：建立棕榈酸(palmitic acid，PA)诱导的肝细胞脂质过载模型，探讨上调CREBH基因的表达，是否影响肝细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)、自噬相关基因的表达以及细胞自噬流的动态过程。
方法：1、用400μMPA干预AML12和LO2肝细胞系24h,诱导肝细胞脂质过载模型;HBSS(Hanks平衡盐溶液)饥饿处理LO2肝细胞不同时间(0、0.5、1、2、4h)诱导自噬。采用qRT-PCR和Westernblot方法检测CREBH和自噬相关基因的表达。2、以慢病毒为载体过表达CREBH，转染并筛选稳定过表达CREBH的慢病毒(Lv-CREBH)或空载慢病毒(Lv-Null)的AML12和LO2肝细胞株，分别给予400μMPA干预24h。采用qRT-PCR和Westernblot方法检测ERS信号蛋白和自噬相关基因的表达；采用吖啶橙染色，在激光共聚焦显微镜下观察细胞内自噬的变化。
3、过表达CREBH的稳转肝细胞株，给予400μMPA和自噬溶酶体抑制剂(20μMCQ或10μMBaf-A1)干预24h,qRT-PCR和Westernblot方法检测自噬相关基因的表达；LC3-GFP-mCherry双标质粒转染上述稳转肝细胞株，并给予PA和自噬溶酶体抑制剂(CQ或Baf-A1)干预24h后，在激光共聚焦显微镜下观察细胞内自噬流的变化情况。
结果：1、在PA诱导的AML12和LO2肝细胞脂质过载体外模型中，我们发现CREBH的表达及活化增加，自噬流被抑制；在HBSS诱导的LO2细胞饥饿模型中，自噬被诱导，CREBH的表达及活化增加：饥饿1h时LC3II/I比值最大，随后被消耗降低；同时，饥饿1h时CREBH的表达及活化出现显著上调随后保持稳定。即在PA和饥饿诱导的不同代谢应激条件下，CREBH均被激活，自噬发生不同的变化。
2、成功验证过表达CREBH的AML12和LO2稳转细胞株。在PA诱导的肝细胞脂质过载模型中发现，与空载组(Lv-Null)细胞相比，过表达CREBH组(Lv-CREBH)细胞内的ERS信号蛋白表达显著降低，LC3II/I比值增加，但自噬体形成相关基因的表达无明显变化。吖啶橙染色显示，在Lv-Null细胞中，红色酸性液泡在PA干预后减少；与Lv-Null组相比，过表达CREBH细胞内(伴或不伴PA干预)红色酸性液泡均增加。实验结果提示过表达CREBH可能改善ERS和自噬流，但对自噬体形成无明显作用。
3、Westernblot显示，在PA诱导的肝细胞脂质过载模型中,自噬溶酶体抑制剂CQ或Baf-A1干预后P62蛋白和LC3II/I比值显著增加，提示自噬流的抑制。与Lv-Null相比，过表达CREBH可抑制CQ或Baf-A1诱导的P62蛋白和LC3II/I比值的升高，提示自噬流的改善。LC3-GFP-mCherry双标质粒转染Lv-Null和Lv-CREBH细胞株后激光共聚焦显微镜观察发现，在PA诱导的肝细胞脂质过载模型中，自噬溶酶体抑制剂CQ或Baf-A1干预后黄色斑点(自噬体)显著增加；而与Lv-Null相比，过表达CREBH可使CQ或Baf-A1干预后黄色斑点(自噬体)明显减少，红色斑点(自噬溶酶体)增加。提示在PA诱导的脂质过载模型中，过表达CREBH能改善自噬溶酶体抑制导致的自噬流障碍。
结论：在PA诱导的肝胞脂质过载模型中，肝细胞发生ERS和自噬流障碍，过表达CREBH可发挥改善ERS、恢复自噬流的作用。CREBH可能通过促进自噬体-溶酶体的融合，在自噬后期阶段调节自噬流。
第二部分调节CREBH的表达在NASH小鼠模型中对肝脏损伤和自噬的影响
目的：探讨在高脂(high fat，HF)和蛋氨酸胆碱缺乏(methionine choline deficiency， MCD)饮食诱导的NASH小鼠模型中CREBH的表达变化，以及调节CREBH的表达对NASH小鼠肝脏组织损伤、ERS和自噬活性水平的影响。
方法：1、在HF饮食14W、HF饮食24W和MCD饮食4W诱导的小鼠NAFLD/NASH模型中，采用qRT-PCR和Westernblot方法检测CREBH的表达变化。
2、构建并繁育CREBH基因敲除(KO)小鼠，以野生型(WT)小鼠为对照，建立HF饮食24W和MCD饮食4W诱导的NASH模型。通过进行血清脂质和转氨酶等生化指标检测，肝组织切片H&E、油红O和MASSON染色，qRT-PCR检测炎症和纤维化指标基因表达，和Westernblot检测ERS相关信号蛋白的表达等评估肝脏损伤情况。通过qRT-PCR、Westernblot、免疫荧光检测自噬相关蛋白的表达情况，电镜观察肝细胞脂滴、内质网、自噬体和自噬溶酶体的形态及数量。
3、经小鼠尾静脉注射过表达CREBH的腺相关病毒(AAV-CREBH)或空载对照病毒(AAV-Null)，建立HF饮食24W诱导的NASH模型。通过进行血清脂质和转氨酶等生化指标检测，肝组织切片H&E和油红O染色，Westernblot检测ERS相关信号蛋白的表达等评估肝脏损伤情况。通过qRT-PCR、Westernblot、免疫荧光检测自噬相关蛋白的表达情况，电镜观察肝细胞脂滴、内质网、自噬体和自噬溶酶体的形态及数量。
结果：1、HF饮食14W诱导CREBH的表达和活化上调；与对照饮食(CD)组相比，HF饮食24W时，CREBH的表达和活化水平无明显差异；MCD饮食4W抑制CREBH的表达及活化。
2、在HF/MCD饮食诱导的NASH模型中，敲除CREBH基因加重肝组织损伤、ERS和自噬流障碍。在WT小鼠，与CD组相比，HF饮食24W和MCD饮食4W诱导NASH，表现为血清高TG和转氨酶水平升高，肝组织出现明显的脂质堆积、气球样变和炎症，ERS信号蛋白表达增加。在CD饮食状态，敲除CREBH后肝脏无明显组织损伤。在HF饮食和MCD饮食诱导的NASH模型中，与WT小鼠相比，敲除CREBH基因的小鼠血清TG和转氨酶水平升高，肝脏质堆积减少，但气球样变、炎症和纤维化更加严重，ERS信号蛋白表达增加，电镜显示肝细胞内质网腔明显扩张，提示肝脏损伤更加严重。
与WT组小鼠相比，KO组小鼠均出现：溶酶体膜相关蛋白LAMP1表达明显减少，LC3和P62荧光斑点堆积，电镜下观察到的自噬体增加及自噬溶酶体减少，提示自噬流障碍。在HF/MCD饮食状态下，与WT组相比，KO组小鼠肝脏内自噬流障碍更加明显。敲除CREBH基因对自噬体形成相关基因无明显影响。
3、在HF饮食诱导的NASH模型中，过表达CREBH可促进自噬流、减轻ERS和肝组织损伤。在CD饮食状态下，过表达CREBH对小鼠肝脏无明显影响。在HF饮食诱导的NASH小鼠，过表达CREBH可降低由HF饮食诱导升高的血脂和血清转氨酶水平，抑制肝脏脂质堆积，气球样变和炎症，抑制ERS信号蛋白的表达，增加溶酶体膜相关蛋白LAMP1和LAMP2的表达，增加LC3II/LC3I并减少P62蛋白堆积，电镜下观察到的自噬溶酶体增加。过表达CREBH对自噬体形成相关基因的表达无明显影响。
结论：CREBH的表达及活化在NAFLD前期增加，在NASH阶段被抑制。在HF或MCD饮食诱导的NASH模型中，CREBH具有缓解小鼠肝脏组织损伤、ERS和自噬流障碍的作用。
第三部分CREBH调节肝脏自噬流的机制研究
目的：在体外和体内实验中探讨CREBH调节肝脏自噬流的机制，并明确CREBH是否对调节自噬流的基因具有直接转录调控作用。
方法：1、在HF饮食喂养的CREBH基因敲除的NASH模型中，进行RNA-Seq测序，对测序结果进行聚类分析，GO和KEGG功能分析，在WT和KO小鼠筛选出组间具有mRNA表达量差异的自噬相关基因，并通过qRT-PCR方法对这些基因的mRNA表达水平进行验证。
2、在CREBH基因敲除和MCD饮食诱导NASH模型的小鼠肝脏、尾静脉注射AAV过表达CREBH的CD饮食小鼠肝脏，及相应的对照组中，采用qRT-PCR方法检测对上述筛选出的基因mRNA表达水平进行检测，筛选出具有一致性变化的自噬相关基因，即Coro1a和Atg14。在HF饮食诱导的NASH模型小鼠中，采用Westernblot方法检测Coro1a和Atg14的蛋白表达水平。
3、在稳定过表达CREBH(Lv-CREBH)及对应空载对照(Lv-Null)的LO2肝细胞中，采用qRT-PCR方法检测Coro1a和Atg14的mRNA表达水平。染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，CHIP)和双荧光素酶报告基因的方法检测CREBH对Coro1a和Atg14是否具有直接转录调控作用。
结果：1、在HF饮食喂养的CREBH基因敲除的NASH模型小鼠肝脏中，RNA-Seq基因测序筛选出的mRNA表达量具有差异的10个自噬相关基因为：Dram1、Dcn、Atg14、Mtcl1、Sh3bp4、Trp53inp2、Ctsk、Pycard、Srpx、Coro1a。
2、对上述10个基因进行qRT-PCR检测后，挑选出mRNA表达在HF饮食和MCD饮食诱导的敲除CREBH的NASH模型小鼠中趋势一致，但与过表达CREBH的CD饮食小鼠趋势相反的基因，即Coro1a和Atg14。查阅文献发现Coro1a抑制自噬，Atg14促进自噬。与CREBH促进自噬的结果一致，敲除CREBH上调Coro1a的基因及蛋白表达，但下调Atg14的基因及蛋白表达；过表达CREBH抑制Coro1a的基因及蛋白表达，促进Atg14的基因及蛋白表达。
3、在LO2细胞株中，过表达CREBH下调Coro1a的mRNA表达，但对Atg14的mRNA表达无明显影响。CHIP和双荧光素酶报告基因结果提示CREBH可与Coro1a启动子区域结合，而对Atg14的启动子区域无明显作用。
结论：在肝脏中，CREBH可能通过靶向负性调控Coro1a的表达和间接促进Atg14的表达促进自噬体-溶酶体融合，进而促进自噬流。
目的：建立棕榈酸(palmitic acid，PA)诱导的肝细胞脂质过载模型，探讨上调CREBH基因的表达，是否影响肝细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)、自噬相关基因的表达以及细胞自噬流的动态过程。
方法：1、用400μMPA干预AML12和LO2肝细胞系24h,诱导肝细胞脂质过载模型;HBSS(Hanks平衡盐溶液)饥饿处理LO2肝细胞不同时间(0、0.5、1、2、4h)诱导自噬。采用qRT-PCR和Westernblot方法检测CREBH和自噬相关基因的表达。2、以慢病毒为载体过表达CREBH，转染并筛选稳定过表达CREBH的慢病毒(Lv-CREBH)或空载慢病毒(Lv-Null)的AML12和LO2肝细胞株，分别给予400μMPA干预24h。采用qRT-PCR和Westernblot方法检测ERS信号蛋白和自噬相关基因的表达；采用吖啶橙染色，在激光共聚焦显微镜下观察细胞内自噬的变化。
3、过表达CREBH的稳转肝细胞株，给予400μMPA和自噬溶酶体抑制剂(20μMCQ或10μMBaf-A1)干预24h,qRT-PCR和Westernblot方法检测自噬相关基因的表达；LC3-GFP-mCherry双标质粒转染上述稳转肝细胞株，并给予PA和自噬溶酶体抑制剂(CQ或Baf-A1)干预24h后，在激光共聚焦显微镜下观察细胞内自噬流的变化情况。
结果：1、在PA诱导的AML12和LO2肝细胞脂质过载体外模型中，我们发现CREBH的表达及活化增加，自噬流被抑制；在HBSS诱导的LO2细胞饥饿模型中，自噬被诱导，CREBH的表达及活化增加：饥饿1h时LC3II/I比值最大，随后被消耗降低；同时，饥饿1h时CREBH的表达及活化出现显著上调随后保持稳定。即在PA和饥饿诱导的不同代谢应激条件下，CREBH均被激活，自噬发生不同的变化。
2、成功验证过表达CREBH的AML12和LO2稳转细胞株。在PA诱导的肝细胞脂质过载模型中发现，与空载组(Lv-Null)细胞相比，过表达CREBH组(Lv-CREBH)细胞内的ERS信号蛋白表达显著降低，LC3II/I比值增加，但自噬体形成相关基因的表达无明显变化。吖啶橙染色显示，在Lv-Null细胞中，红色酸性液泡在PA干预后减少；与Lv-Null组相比，过表达CREBH细胞内(伴或不伴PA干预)红色酸性液泡均增加。实验结果提示过表达CREBH可能改善ERS和自噬流，但对自噬体形成无明显作用。
3、Westernblot显示，在PA诱导的肝细胞脂质过载模型中,自噬溶酶体抑制剂CQ或Baf-A1干预后P62蛋白和LC3II/I比值显著增加，提示自噬流的抑制。与Lv-Null相比，过表达CREBH可抑制CQ或Baf-A1诱导的P62蛋白和LC3II/I比值的升高，提示自噬流的改善。LC3-GFP-mCherry双标质粒转染Lv-Null和Lv-CREBH细胞株后激光共聚焦显微镜观察发现，在PA诱导的肝细胞脂质过载模型中，自噬溶酶体抑制剂CQ或Baf-A1干预后黄色斑点(自噬体)显著增加；而与Lv-Null相比，过表达CREBH可使CQ或Baf-A1干预后黄色斑点(自噬体)明显减少，红色斑点(自噬溶酶体)增加。提示在PA诱导的脂质过载模型中，过表达CREBH能改善自噬溶酶体抑制导致的自噬流障碍。
结论：在PA诱导的肝胞脂质过载模型中，肝细胞发生ERS和自噬流障碍，过表达CREBH可发挥改善ERS、恢复自噬流的作用。CREBH可能通过促进自噬体-溶酶体的融合，在自噬后期阶段调节自噬流。
第二部分调节CREBH的表达在NASH小鼠模型中对肝脏损伤和自噬的影响
目的：探讨在高脂(high fat，HF)和蛋氨酸胆碱缺乏(methionine choline deficiency， MCD)饮食诱导的NASH小鼠模型中CREBH的表达变化，以及调节CREBH的表达对NASH小鼠肝脏组织损伤、ERS和自噬活性水平的影响。
方法：1、在HF饮食14W、HF饮食24W和MCD饮食4W诱导的小鼠NAFLD/NASH模型中，采用qRT-PCR和Westernblot方法检测CREBH的表达变化。
2、构建并繁育CREBH基因敲除(KO)小鼠，以野生型(WT)小鼠为对照，建立HF饮食24W和MCD饮食4W诱导的NASH模型。通过进行血清脂质和转氨酶等生化指标检测，肝组织切片H&E、油红O和MASSON染色，qRT-PCR检测炎症和纤维化指标基因表达，和Westernblot检测ERS相关信号蛋白的表达等评估肝脏损伤情况。通过qRT-PCR、Westernblot、免疫荧光检测自噬相关蛋白的表达情况，电镜观察肝细胞脂滴、内质网、自噬体和自噬溶酶体的形态及数量。
3、经小鼠尾静脉注射过表达CREBH的腺相关病毒(AAV-CREBH)或空载对照病毒(AAV-Null)，建立HF饮食24W诱导的NASH模型。通过进行血清脂质和转氨酶等生化指标检测，肝组织切片H&E和油红O染色，Westernblot检测ERS相关信号蛋白的表达等评估肝脏损伤情况。通过qRT-PCR、Westernblot、免疫荧光检测自噬相关蛋白的表达情况，电镜观察肝细胞脂滴、内质网、自噬体和自噬溶酶体的形态及数量。
结果：1、HF饮食14W诱导CREBH的表达和活化上调；与对照饮食(CD)组相比，HF饮食24W时，CREBH的表达和活化水平无明显差异；MCD饮食4W抑制CREBH的表达及活化。
2、在HF/MCD饮食诱导的NASH模型中，敲除CREBH基因加重肝组织损伤、ERS和自噬流障碍。在WT小鼠，与CD组相比，HF饮食24W和MCD饮食4W诱导NASH，表现为血清高TG和转氨酶水平升高，肝组织出现明显的脂质堆积、气球样变和炎症，ERS信号蛋白表达增加。在CD饮食状态，敲除CREBH后肝脏无明显组织损伤。在HF饮食和MCD饮食诱导的NASH模型中，与WT小鼠相比，敲除CREBH基因的小鼠血清TG和转氨酶水平升高，肝脏质堆积减少，但气球样变、炎症和纤维化更加严重，ERS信号蛋白表达增加，电镜显示肝细胞内质网腔明显扩张，提示肝脏损伤更加严重。
与WT组小鼠相比，KO组小鼠均出现：溶酶体膜相关蛋白LAMP1表达明显减少，LC3和P62荧光斑点堆积，电镜下观察到的自噬体增加及自噬溶酶体减少，提示自噬流障碍。在HF/MCD饮食状态下，与WT组相比，KO组小鼠肝脏内自噬流障碍更加明显。敲除CREBH基因对自噬体形成相关基因无明显影响。
3、在HF饮食诱导的NASH模型中，过表达CREBH可促进自噬流、减轻ERS和肝组织损伤。在CD饮食状态下，过表达CREBH对小鼠肝脏无明显影响。在HF饮食诱导的NASH小鼠，过表达CREBH可降低由HF饮食诱导升高的血脂和血清转氨酶水平，抑制肝脏脂质堆积，气球样变和炎症，抑制ERS信号蛋白的表达，增加溶酶体膜相关蛋白LAMP1和LAMP2的表达，增加LC3II/LC3I并减少P62蛋白堆积，电镜下观察到的自噬溶酶体增加。过表达CREBH对自噬体形成相关基因的表达无明显影响。
结论：CREBH的表达及活化在NAFLD前期增加，在NASH阶段被抑制。在HF或MCD饮食诱导的NASH模型中，CREBH具有缓解小鼠肝脏组织损伤、ERS和自噬流障碍的作用。
第三部分CREBH调节肝脏自噬流的机制研究
目的：在体外和体内实验中探讨CREBH调节肝脏自噬流的机制，并明确CREBH是否对调节自噬流的基因具有直接转录调控作用。
方法：1、在HF饮食喂养的CREBH基因敲除的NASH模型中，进行RNA-Seq测序，对测序结果进行聚类分析，GO和KEGG功能分析，在WT和KO小鼠筛选出组间具有mRNA表达量差异的自噬相关基因，并通过qRT-PCR方法对这些基因的mRNA表达水平进行验证。
2、在CREBH基因敲除和MCD饮食诱导NASH模型的小鼠肝脏、尾静脉注射AAV过表达CREBH的CD饮食小鼠肝脏，及相应的对照组中，采用qRT-PCR方法检测对上述筛选出的基因mRNA表达水平进行检测，筛选出具有一致性变化的自噬相关基因，即Coro1a和Atg14。在HF饮食诱导的NASH模型小鼠中，采用Westernblot方法检测Coro1a和Atg14的蛋白表达水平。
3、在稳定过表达CREBH(Lv-CREBH)及对应空载对照(Lv-Null)的LO2肝细胞中，采用qRT-PCR方法检测Coro1a和Atg14的mRNA表达水平。染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，CHIP)和双荧光素酶报告基因的方法检测CREBH对Coro1a和Atg14是否具有直接转录调控作用。
结果：1、在HF饮食喂养的CREBH基因敲除的NASH模型小鼠肝脏中，RNA-Seq基因测序筛选出的mRNA表达量具有差异的10个自噬相关基因为：Dram1、Dcn、Atg14、Mtcl1、Sh3bp4、Trp53inp2、Ctsk、Pycard、Srpx、Coro1a。
2、对上述10个基因进行qRT-PCR检测后，挑选出mRNA表达在HF饮食和MCD饮食诱导的敲除CREBH的NASH模型小鼠中趋势一致，但与过表达CREBH的CD饮食小鼠趋势相反的基因，即Coro1a和Atg14。查阅文献发现Coro1a抑制自噬，Atg14促进自噬。与CREBH促进自噬的结果一致，敲除CREBH上调Coro1a的基因及蛋白表达，但下调Atg14的基因及蛋白表达；过表达CREBH抑制Coro1a的基因及蛋白表达，促进Atg14的基因及蛋白表达。
3、在LO2细胞株中，过表达CREBH下调Coro1a的mRNA表达，但对Atg14的mRNA表达无明显影响。CHIP和双荧光素酶报告基因结果提示CREBH可与Coro1a启动子区域结合，而对Atg14的启动子区域无明显作用。
结论：在肝脏中，CREBH可能通过靶向负性调控Coro1a的表达和间接促进Atg14的表达促进自噬体-溶酶体融合，进而促进自噬流。