【摘 要】
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目前我国原发性血小板减少性紫癜(ITP)、继发性血小板减少性紫癜和化疗及骨髓移植等引起的血小板减少症正在逐年增加。传统治疗方法有输注血小板、激素治疗等,但这些治疗方法
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目前我国原发性血小板减少性紫癜(ITP)、继发性血小板减少性紫癜和化疗及骨髓移植等引起的血小板减少症正在逐年增加。传统治疗方法有输注血小板、激素治疗等,但这些治疗方法在,临床中出现了免疫反应、二次传染等副作用,这给患者造成了身体伤害。TPO(促血小板生成素)是一种巨核细胞和血小板生成的主要调节因子。1994年,TPO分子被发现、克隆,并且开始进行临床开发,TPO基因药物由于在I、II期临床试验中发现给药后可产生与内源性TPO起交叉反应的中和性抗体,导致持久性血小板减少,在美国已停止进行临床试验。TMP(TPO模拟肽)是由14个氨基酸构成的TPO肽类模拟物,与TPO基因无序列同源性。研究表明TMP能够与TPO竞争性结合在c-mpl上有效促进血小板生成,TMP二聚体具有与促血小板生成素(TPO)同样的功效,而且在人体内不会诱导产生与内源性TPO起交叉反应的中和性抗体。但是TMP存在半衰期短的缺点,无法在体内有效发挥促进血小板生成的功效。本论文以实验室构建的毕赤酵母HSA-TMP工程菌株为发酵菌株,在20 L发酵罐中对中试表达HSA-TMP融合蛋白的发酵条件进行了研究。通过研究工程酵母生长曲线,基础盐发酵培养基对酵母生长的影响以及不同诱导条件对目的蛋白表达量的影响,得出了较佳的中试发酵条件:在发酵罐中,培养温度为29℃,诱导温度为27℃,pH=5的条件下,通过对发酵罐各个参数的精细调节,在溶氧不低于20%的条件下,酵母菌在培养约36 h后(即甘油耗尽1h后)结束生物量积累阶段,进入甲醇诱导表达阶段;经过约96 h的发酵,菌体湿重可达到500 g/L左右,此时目的蛋白HSA-TMP的表达量为1 g/L,且生物学活性最佳。本研究得到了利用毕赤酵母中试发酵生产HSA-TMP融合蛋白的初步条件,为利用毕赤酵母表达系统生产第二代促血小板生成素提供了有价值的数据。
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