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一、背景与目的:在胚胎着床和发育过程中,子宫内膜基质细胞的分化及新生血管网络的形成对于妊娠的建立和维持至关重要。而岩藻糖基转移酶及岩藻糖化寡糖在子宫内膜接受态的建立及胚胎着床发育过程中发挥重要作用。蛋白质O-岩藻糖基转移酶1(po FUT1)定位于细胞内质网,通过特异性识别催化含类表皮生长因子(EGF)结构域的底物,将L-Fucose以O-糖苷键的形式连接到蛋白质丝氨酸或苏氨酸残基上,形成O-连接型岩藻化糖蛋白。实验室前期研究表明,po FUT1可以增强胚胎滋养层细胞的植入和增殖能力,在子宫内膜接受态的建立及胚胎着床发育过程中发挥重要作用,但其在子宫蜕膜血管形成过程中所起的作用目前未见报道。本研究旨在探讨po FUT1对子宫蜕膜血管形成的影响及作用机制,为进一步深入理解妊娠生理及诊断治疗临床相关病理性妊娠及妊娠期并发症提供新的思路和理论依据。二、方法:1.组织免疫荧光检测正常未孕和早孕妇女及小鼠子宫内膜组织中po FUT1和血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)标志物表达水平。2.体外诱导人子宫内膜基质细胞(human endometrial stromal cells,HESCs)蜕膜化,并使用血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)进行刺激,应用Real-time PCR、Western blot、细胞免疫荧光方法检测po FUT1和VECs标志物的表达水平;应用小管形成实验分析细胞成管能力。3.利用脂质体瞬时转染po FUT1-si RNA至蜕膜化的基质细胞(human decidual stromal cells,HDSCs)内,下调po FUT1表达,应用Real-time PCR、Western blot、细胞免疫荧光方法检测VECs标志物的表达水平;应用细胞骨架染色检测细胞骨架改变情况,应用划痕实验分析细胞迁移能力,应用小管形成实验分析细胞成管能力。4.蛋白质免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)和O-Fucose试剂盒检测HDSCs中尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,u PA)上O-岩藻糖含量。5.Western blot检测HDSCs中Rho A信号通路相关分子的表达。6.对受孕小鼠进行po FUT1-si RNA宫角注射,体内验证下调po FUT1抑制小鼠子宫蜕膜血管形成。三、结果:1.组织免疫荧光结果显示:与正常未孕女性增生期子宫内膜组织相比,分泌期子宫内膜组织血管数量多、管腔大,po FUT1和VECs标志物(CD31)高表达,正常早孕女性子宫蜕膜组织血管管腔显著扩张,po FUT1和CD31的表达更未显著;正常早期妊娠小鼠子宫内膜组织中po FUT1和CD31的表达随着妊娠的进展而递增。2.蜕膜化诱导和VEGF作用促进HESCs中po FUT1表达,增强其成管能力。诱导HESCs蜕膜化后,Real-time PCR、Western Blot、细胞免疫荧光实验结果显示:与对照组相比,HESCs蜕膜化诱导后po FUT1和VECs标志物的表达上调,加入VEGF后其表达进一步增加。小管形成实验结果显示:蜕膜化后HESCs形成血管的能力与对照组相比更强,而加入VEGF作用以后成管能力进一步增强。3.po FUT1促进HDSCs血管形成能力。Real-time PCR、Western blot、细胞免疫荧光实验结果显示:HDSCs转染po FUT1-si RNA后VECs标志物表达下调,而当与po FUT1-c DNA共转染后,VECs标志物表达部分回调。细胞骨架染色、划痕实验和小管形成实验结果显示:HDSCs转染po FUT1-si RNA后,细胞骨架形成,细胞迁移能力和成管能力均受到抑制,而当与po FUT1-c DNA共转染后,细胞骨架纤维形成的抑制作用减弱,细胞迁移能力和成管能力部分回调。4.po FUT1通过上调u PA上的O-岩藻糖基化的修饰,从而激活Rho A信号通路。Western blot结果显示:转染po FUT1-si RNA后可显著下调HDSCs中O-Fucose的表达,而与po FUT1-c DNA共转染后,总蛋白O-Fucose的表达回调。为了寻找具体是哪一种蛋白质上的O-岩藻糖基化发生改变,影响子宫蜕膜血管形成,我们通过生物信息学预测(Uni Prot)发现:u PA上含有O-岩藻糖基化修饰位点。co-IP实验结果显示:与对照组相比,转染po FUT1-si RNA后,u PA上的O-Fucose表达下调,而与po FUT1-c DNA共同转染后,u PA上的O-fucose表达回调;共同转染po FUT1-c DNA和u PA-c DNA后,经O-岩藻糖基化修饰的u PA含量增加,而共同转染po FUT1-c DNA和u PA-mutant-c DNA后,经O-岩藻糖基化修饰的u PA含量不发生明显改变,由此证明,u PA上含有O-岩藻糖基化修饰位点。为了证明经O-Fucose修饰的u PA含量的改变对Rho A信号通路产生影响,做如下验证:同时转染po FUT1-c DNA和u PA-c DNA后Rho A信号通路相关分子(Rho A-GTP、p-LIMK、p-cofilin)的表达上调,而共同转染po FUT1-c DNA和u PA-mutant-c DNA后这些分子表达未发生明显变化。为进一步证明u PA对此通路的影响受到po FUT1的调节,做如下验证:上调po FUT1表达可以激活Rho A信号通路相关分子的表达,而在转染po FUT1-c DNA的同时使用u PA-Ab抑制u PA的作用或者使用Rho A抑制剂(C3transferase)抑制通路的激活,则这些分子的表达受到抑制。5.po FUT1通过上调u PA上的O-岩藻糖基化的修饰,激活Rho A信号通路,进而促进HDSCs的血管形成能力。细胞骨架染色、划痕实验和小管形成实验结果显示:共同转染po FUT1-c DNA和u PA-c DNA后,促进细胞骨架形成,细胞迁移能力和小管形成能力均提高,而共同转染po FUT1-c DNA和u PA-mutant-c DNA后,细胞骨架形成、细胞迁移能力和小管形成能力未发生明显变化;上调po FUT1表达可以促进细胞骨架形成,增强细胞迁移能力和成管能力,而在转染po FUT1-c DNA的同时使用u PA-Ab或者Rho A抑制,则细胞骨架形成、细胞迁移能力和小管形成能力均受到抑制。6.小鼠体内实验进一步证明:正常妊娠小鼠宫角注射po FUT1-si RNA后子宫蜕膜血管形成的数量显著减少,血管直径明显缩小,胚胎着床率显著降低(D8.5)。四、结论:1.po FUT1和CD31在人和小鼠的子宫内膜组织中有表达,正常未孕女性增生期低表达,分泌期高表达,正常早孕女性蜕膜组织中显著表达;正常妊娠的小鼠子宫内膜组织中其表达量随小鼠妊娠进展而递增。2.蜕膜化诱导和VEGF作用促进HESCs中po FUT1的表达,增强其成管能力;反之,po FUT1增强经蜕膜化诱导和VEGF作用后的HESCs血管形成能力。3.po FUT1通过上调u PA上O-岩藻糖基化的修饰,激活Rho A信号通路从而促进HDSCs血管形成能力。