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背景:腹泻是严重危害人类健康的重要疾病之一,全球每年约有40亿人次发病,并造成300～400万患者死亡。纵然很多治疗措施和药物已被采用,但在全球范围内,腹泻总体的发病率和死亡率未见明显改善,即便在发达国家,儿童腹泻也有较高的发病率和死亡率,因而寻求新的治疗腹泻药物成为当代研究的热点。生理状态下,肠道上皮细胞存在大量离子通道及转运体,维持肠道的吸收和分泌处于平衡状态。但当致泻因素或物质,如细菌、病毒感染和毒素等作用于肠道时,这些离子通道及转运体的表达和(或)活性就会发生改变,从而打破吸收和分泌间的平衡,造成大量的水电解质丢失,严重者可导致患者死亡,因而腹泻的本质在于肠道分泌功能与吸收功能之间的平衡失调。在过去的几十年中,科研工作者一直致力于寻找影响肠道吸收或分泌的药物,小檗碱作为其中候选的一员,对霍乱毒素或致肠病性大肠杆菌引起的分泌性腹泻具有良好的疗效,提示小檗碱可能通过影响肠道的分泌或吸收来发挥治疗腹泻的作用。小檗碱(berberine)是从黄连、黄柏等多种植物中提取(或人工合成)的生物碱,具有广泛的生物学作用,主要包括:抑制病原微生物的代谢,抑制肠液积聚及电解质分泌,抑制炎症反应,刺激胆汁及胆红素分泌以及抑制快速性室性心律不齐等等,但最为主要的还是用于腹泻的治疗。在中国,小檗碱作为传统中药黄连素的主要成分,用于治疗腹泻已有数千年的历史,但其作用机制目前还未完全阐明。既往研究认为小檗碱主要通过抑菌作用来实现腹泻的治疗,但是仅仅抑菌作用并不能解释全部,特别是分泌性腹泻。在动物模型,小檗碱可以逆转霍乱毒素引起的腹泻,提示小檗碱能够影响肠道的分泌与吸收。更为重要的是,小檗碱是目前中药中为数不多的可以人工合成的小分子化合物。通过对其生物学活性及作用机制的进一步探讨,不仅有助于了解其分子机制和作用靶点,而且可以通过建立的分子作用模型,为获得更为高效的腹泻治疗药物奠定基础。目的:1.建立腹泻模型,观察小檗碱的治疗效果2.研究小檗碱是否通过影响离子通道及转运体的表达来达到治疗腹泻的效果3.初步探讨小檗碱影响离子通道及转运体表达的可能分子机制方法:1.将BALB/c小鼠随机分为空白对照组、腹泻组和小檗碱处理组,分别给予生理盐水、20mg/kg番泻苷A、以及20mg/kg番泻苷A和80mg/kg小檗碱灌胃。计数灌胃后12h内小鼠出现的腹泻次数及小鼠的体重变化,观察小檗碱的治疗效果。2.刮取小鼠近端结肠上皮细胞,采用半定量RT-PCR检测影响肠道吸收和分泌的主要离子通道:钠-氢交换体家族(NHE1-NHE3)、水通道蛋白家族(AQP4和AQP8)、AE1、CFTR、和SGLT1的表达变化。3.利用免疫组织化学的方法验证RT-PCR的结果。4.应用RT-PCR和western blotting方法在人肠上皮细胞(HIEC)中作进一步证实。结果:1. 20mg/kg番泻苷A灌胃1～1.5h后,所有小鼠均出现明显的腹泻症状,腹泻症状约持续5～6h。在连续灌胃的7天中,腹泻组小鼠出现消瘦、体重减轻症状,而对照组小鼠均未出现腹泻、消瘦及体重减轻的症状。通过计数灌胃后12h内糊状便及水样便次数,可发现腹泻组小鼠出现糊状便及水样便的次数较对照组相比明显增多(8.57±0.1 VS 0±0.0,p<0.05),差别具有统计学意义。2. 80mg/kg小檗碱灌胃后,腹泻症状得到很好的控制,小檗碱处理组小鼠未出现腹泻、消瘦及体重减轻的症状。连续灌胃7天,通过计数灌胃后12h内糊状便及水样便次数,可以发现小檗碱处理组小鼠出现糊状便及水样便的次数明显少于腹泻组(0.14±0.05 VS 8.57±0.1, p<0.05),具有统计学意义。3. RT-PCR结果显示NHE1、NHE2、NHE3、AQP4、AQP8、AE1、CFTR和SGLT1在小鼠近端结肠上皮细胞均存在一定程度的表达。与空白对照组小鼠相比,腹泻组小鼠NHE1、NHE2、NHE3、AQP4、AQP8、CFTR和SGLT1的表达明显下调,而AE1的表达没有显著性变化。与腹泻组小鼠相比,小檗碱处理组小鼠NHE2、NHE3、AQP4和AQP8的表达明显上调,具有统计学意义(P<0.05),而NHE1、CFTR和SGLT1的表达没有显著性变化。4.免疫组化结果显示NHE3和AQP4蛋白主要表达于近端结肠上皮刷状缘,腹泻组小鼠NHE3和AQP4蛋白呈少量表达乃至阴性表达,而接受小檗碱处理的小鼠,其近端结肠上皮细胞NHE3和AQP4蛋白呈中度表达。5.在人肠上皮细胞系HIEC,RT-PCR结果表明,与单用番泻苷A处理相比,番泻苷A和小檗碱共处理的HIEC细胞,其NHE3 mRNA的表达水平上调了约2倍,同样AQP4的表达增加了1.5倍。Western blotting的结果也提示番泻苷A和小檗碱共处理的HIEC细胞,其NHE3和AQP4蛋白的表达水平较单用番泻苷A处理的HIEC细胞明显增加(p<0.05),具有统计学意义。结论:1.小檗碱对番泻苷A诱导产生的腹泻具有很好的治疗作用。2.小檗碱可上调NHE3和AQP4的表达,提示小檗碱可能通过增强水钠的吸收来发挥治疗腹泻的作用。3.NHE3和AQP4的调节剂可用于腹泻的治疗。