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鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我国常见的恶性肿瘤之一,尤其以广东、广西最为多见,发病率可高达30/10万。由于早期鼻咽癌症状不明显导致患者就诊时往往已到中晚期,而目前以放、化疗为主的治疗方法只能使5年生存率达到50%～70%左右,且众多的放疗后并发症又严重影响着患者的生存质量,目前临床上对鼻咽癌的治疗已达瓶颈期,迫切需要一种新型有效的治疗方式来弥补放、化疗的不足。光动力学治疗（photodynamictherapy,PDT）自20世纪80年代初兴起以来,由于其选择性好,毒性小,起效快,可重复和与其他传统疗法协同作用等优点越来越受到人们的重视,随着新型光敏剂的发现,激光器的完善及临床经验的积累,PDT已成为肿瘤治疗的又一种新选择。5—氨基酮戊酸（5-aminolevulinic acid,5-ALA）作为具有较强光敏作用的原卟啉Ⅸ生物合成前体,5-ALA及其某些酯类近几年被用于光动力治疗,5-ALA本身不是光敏剂,是光敏剂原卟啉的生物合成前体。本课题欲从体外、体内多个方面探讨5-ALA-PDT在鼻咽癌治疗中应用的可能性。第一部分5-ALA对体外培养人鼻咽癌细胞CNE2系的光灭活作用目的:探索5-ALA介导的光动力治疗在体外环境中对鼻咽癌细胞的光灭活作用,及5-ALA在细胞内代谢合成PpⅨ的规律、5-ALA暗毒性、5-ALA-PDT最适作用时间、最适作用剂量等。方法:1荧光分光光度法测定5-ALA在肿瘤细胞中合成原卟啉的情况;2荧光倒置相差显微镜观察CNE2细胞吸收后5-ALA合成PpⅨ在细胞内的定位;3 MTT细胞毒实验检测5-ALA对细胞的暗毒性、单纯辐照对细胞的影响、照光剂量对PDT的影响、不同5-ALA孵育时间的影响、血清对5-ALA-PDT的影响;4流式细胞术检测5-ALA-PDT对肿瘤细胞的杀伤作用;5光镜、透射电镜下观察5-ALA-PDT后细胞形态学的改变。结果:1.荧光分光光度法检测发射荧光强度观察PpⅨ的生成量:409nm的蓝紫光能激发细胞内合成的PpⅨ发射出635nm波长的红光,结果显示:产生的PpⅨ只存在于细胞中;2mmol/L5-ALA体外孵育浓度已达饱和;5-ALA吸收后在细胞内产生的PpⅨ量随时间的延长而逐渐增加,10小时前PpⅨ随时间增长得最快。2.荧光倒置相差显微镜观察:5-ALA被CNE2细胞吸收后产生的PpⅨ主要存在于细胞膜和胞浆中。3.MTT细胞毒实验:单纯5-ALA孵育及单纯冷光源激光辐照对肿瘤细胞的生长在10小时内几乎无影响（p＞0.1）;5-ALA孵育浓度和时间一定时,1、2、5、8J辐照剂量的抑制率分别是:1J 34.3±4.6;2J 55.0±3.2;5J 92.0±6.2:8J 85.5±10.9;在光照剂量和强度一定的情况下,延长5-ALA药物的孵育时间可以明显提高PDT效应,但8小时为最长孵育时间,再延长时间对PDT影响不大;动物血清对5-ALA-PDT效应存在着明显的抑制作用,这种抑制作用可以通过增加5-ALA浓度,提高辐照剂量等而得到进一步增强。4.流式细胞术检测不同浓度5-ALA和辐照剂量及血清存在下诱导的细胞凋亡率:2mmol/L 1J 62.3%;2mmol/L 2J 74.5%;2mmol/L 10%FBS2J 11.1%:4mmol/L 10%FBS 2J 28.8%;6mmol/L 10%FBS 2J 75.5%。5.光镜下观察5-ALA-PDT后细胞形态学改变快,数分钟内即可在普通倒置相差显微镜下观察到细胞变圆、变小,细胞内大量的空泡形成、核膜着色加深,8小时后细胞分解成细颗粒状,部分细胞结构尚存。透射电镜下细胞染色质边集凝聚、断裂、核膜出泡及凋亡小体形成,胞浆内线粒体肿胀脱颗粒等。结论:1.5-ALA在细胞内合成的PpⅨ主要存在于细胞胞浆及包膜中,2mmol/L为体外最适浓度;2.单用5-ALA孵育对细胞无毒性;单独辐照对细胞生长无影响;体外适量增大照光剂量可增强PDT对细胞的灭活作用,光剂量5J时达峰值;在5-ALA孵育浓度一致和照光剂量相等的情况下,延长ALA孵育时间可以增强PDT损伤效应;血清对5-ALA-PDT有明显的竞争性抑制作用;3.诱导细胞凋亡为5-ALA-PDT杀伤细胞的主要作用机制,但当药物剂量过高、光剂量太大时,则诱导细胞坏死。第二部分5-ALA对裸鼠人鼻咽癌移植瘤的光动力疗效目的:建立裸鼠人鼻咽癌CNE2荷瘤模型,摸索5-ALA在体内的代谢情况,研究局部和腹腔给药方式下,5-ALA-PDT对肿瘤生长的抑制作用。方法:1.体外培养人鼻咽癌CNE2细胞,以2～5×106/0.2ml接种于裸鼠右腋下。2.荧光分光光度法检测5-ALA在荷瘤小鼠体内各脏器、组织中合成PpⅨ的情况。3.接种人鼻咽癌CNE2细胞,当肿瘤大小达0.1-0.15cm3时随机分成4组,A、D组局部给予20%5-ALA100mg.kg-1,B组腹腔给予20%5-ALA100mg.kg-1,C组为对照组。3～3.5小时后A、B、D接受100mw.100J-1630nm激光照射,24h后D组断颈处死;A、B、C组PDT处理后1、3、7、10、14d用游标卡尺测量肿瘤大小,14d断颈处死,称量3组瘤重。4.取4组肿瘤组织制蜡块做病理切片、电镜检查等。结果:1.人鼻咽癌CNE2细胞接种成功率达100%,8～10天肿瘤大小可达0.1-0.15cm3。2.5-ALA吸收后主要在于肿瘤组织和肝脏中积聚合成PpⅨ,且肝脏组织中的含量高于肿瘤组织。PpⅨ在肝脏内一小时即达高峰,后逐渐下降,5小时与肿瘤组织含量基本一致;而肿瘤组织中的PpⅨ一小时起即可检测到,后逐渐升高,3～4小时左右达峰值,后逐渐下降,瘤旁粘膜、肌肉组织及肺、肾可少量吸收光敏剂而产生PpⅨ,而心脏几乎不含PpⅨ,正常组织除肝脏外与肿瘤组织的吸收比约为1:2～4。3.5-ALA-PDT对小鼠无明显毒副反应,治疗后1天起治疗组与对照肿瘤体积就有明显的差异,14天后A、B、C3组肿瘤重量（g）分别是1.353±0.204、2.105±0.255、3.124±0.380,P=0.000;4.透射电镜观察5-ALA-POT治疗后,细胞体积明显缩小,胞浆内出现大量空泡,为肿胀的线粒体,线粒体嵴短小而显示不清,核内染色质凝集、致密,呈颗粒、块状均质分布在核膜内侧,电子密度高,核中心染色质消失淡染,少数核膜出泡形成凋亡小体,存在与其他细胞周围或被吞噬,呈现典型的凋亡表现。部分边集的染色质断裂,到逐渐溶解消失。同时也存在部分坏死细胞,表现为细胞明显变性、解离、胞质疏松、膨胀,细胞膜破坏,线粒体脱颗粒、消失。病理切片显示PDT治疗后一天,局部血管扩张及弥漫性出血,细胞胞浆内出现大量空泡和多处灶状坏死及凋亡,。PDT治疗后14天,镜下见大片凝固性坏死,细胞核固缩,甚至只残留核形,而无嗜苏木素着色。结论:1.小鼠人鼻咽癌荷瘤模型建立成功;2.5-ALA体内吸收后合成的PpⅨ主要分布于肝脏和肿瘤中,PpⅨ在肝脏中1小时内达峰值,在肿瘤中3小时左右达峰值;3.5-ALA-PDT是安全可靠的治疗方法,能明显抑制人鼻咽癌肿瘤的生长,且局部治疗组明显优于全身治疗组;4.透射电镜和病理切片证实5-ALA-PDT诱导肿瘤细胞凋亡和坏死。第三部分5-ALA-PDT后血管生成、增殖能力及凋亡途径的探讨目的:探讨5-ALA-PDT后血管生成、增殖能力及凋亡途径上的改变方法:1.实时荧光定量PCR检测血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor,VEGF）、增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen,PCNA）、半胱氨酸.天冬氨酸蛋白激酶-3、-8、-9（Caspase3、Caspase8、Caspase9）等基因mRNA水平的改变2.免疫组化检测VEGFA、PCNA的蛋白表达水平及在细胞中的定位3.Western-blot免疫印记法检测VEGFA、PCNA、Caspase9蛋白表达水平的差异及激酶激活状态的差异结果:1.在mRNA检测水平上治疗组1d及14d PCNA、Caspase9均高于对照组;2.免疫组化检测显示VEGFA在治疗后急性期（1d）及全身给药组略高于对照组,而局部给药组略低于对照组,暂无明显统计学差异。PCNA在PDT后1d由于肿瘤细胞的代谢异常,胞核中的PCNA表达下调,核膜周边着色,PDT后14d存活的肿瘤细胞PCNA略高于对照组,p=0.386,暂无明显统计学差异。3.Westem-blotting检测:局部治疗组14dVEGFA蛋白表达明显下调（p=0.000）,PDT后1d组略上调;PCNA总蛋白含量无明显差异;Caspase9的原型减少,激活形式明显增多（p=0.015）。结论:1.VEGFA在mRNA水平无明显统计学差异,蛋白表达水平局部治疗组PDT后14天明显下调,而PDT后1天略为上调;2.PCNA在mRNA水平治疗组1d及14d均明显高于对照组,有统计学差异;总蛋白水平无明显差异,但PDT后1天分布在胞核中的PCNA减少,提示功能上存在差异。3.Caspase9在mRNA水平治疗组均高于对照组;蛋白水平原型的Caspase9减少,而激活形式增多。