背景：腹膜纤维化具有重要临床意义。如慢性腹膜纤维化导致的超滤衰竭为终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）患者腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）退出的重要原因，而急性腹膜纤维化导致的术后腹膜粘连可引起不育、肠梗阻。腹膜间皮细胞（peritoneal mesothelial cells，PMCs）在维持腹膜稳态、物质转运、炎症、组织修复等方面发挥重要作用。PMCs急性或慢性受损，可引起炎症、腹膜纤维化及粘连，同时在慢性刺激作用下部分PMCs从上皮细胞表型向间充质细胞表型发生转化即转分化（epithelial-myofibroblasttransdifferentiation，EMT）亦可启动纤维化进程，导致PD超滤失败或术后腹膜粘连。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可以通过定植、分化和/或分泌生物活性因子以促进内源性干/祖细胞迁移与分化、抑制炎症、抗纤维化，从而促进损伤的修复。目前尚无MSCs与腹膜纤维化的研究。目的：本课题旨在明确1.MSCs能否通过促进PMCs急性机械性损伤修复而减轻急性腹膜纤维化；2.MSCs能否通过抑制慢性腹膜透析中PMCs的EMT而减轻慢性腹膜纤维化。同时探讨MSCs发挥疗效的具体作用机制。方法：MSCs减轻急性腹膜纤维化的研究：建立腹膜机械性刮伤诱导的Sprague-Dawley（SD）大鼠急性腹膜粘连模型。刮伤后不同时间点，将5×106大鼠骨髓来源的红色荧光蛋白（red fluorescent protein，RFP）-MSCs通过尾静脉或腹腔注射入大鼠体内，术后14d，采用腹膜粘连评分观察腹膜粘连的严重程度、明确最佳注射方式与时间点。刮伤后24h，将5×106MSCs通过尾静脉注射入体内。术后采用腹膜粘连评分观察腹膜粘连的严重程度，苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）观察炎症反应，Masson三色染色观察纤维化程度，免疫组织化学分析损伤腹膜区域中性粒细胞（髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO））、单核巨噬细胞（ED-1）、成纤维细胞（成纤维细胞特异性蛋白-1（fibroblast specific protein-1，FSP-1））数量及转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）水平，免疫组化分析间皮细胞（E-Cadherin）及免疫荧光分析间皮细胞、增殖细胞核抗原（proliferating cellnuclear antigen，PCNA），以观察PMCs的修复及增殖。体外培养原代SD大鼠腹膜间皮细胞（rat peritoneal mesothelial cells，RPMCs），利用Transwell共培养系统、通过计算不同时间点的细胞迁移速度、免疫荧光分析E-Cadherin及PCNA，观察MSCs对机械性划伤RPMCs修复的影响。近红外线染料标记的MSCs在腹膜刮伤后24h经大鼠或重症联合免疫缺陷（servere combinedimmune-deficiency，SCID）小鼠尾静脉或腹腔注射，采用小动物活体成像系统示踪MSCs在体内的分布。双光子显微镜、免疫荧光分析MSCs在肺脏、脾脏等器官组织中的聚集、分布情况及其与巨噬细胞的定位关系。将5×106大鼠MSCs的无血清条件培养基（conditioned medium，CM）超滤浓缩后，刮伤后24h、3d、5d通过尾静脉注射入大鼠体内三次。术后采用腹膜粘连评分观察腹膜粘连的严重程度，Masson三色染色观察纤维化程度。采用抗体芯片技术检测无血清饥饿0h、12h、24h的MSCs-CM，分析MSCs-CM中细胞因子分泌的变化，并对变化显著的候选因子采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）验证。采用免疫荧光分析经尾静脉注射后在肺脏中或经腹腔静脉注射后在脾脏中积聚的MSCs的TSG-6表达情况，采用ELISA检测大鼠血清TSG-6水平。肿瘤坏死因子α刺激基因6（tumor necrosis factor α（TNFα）-stimulating gene-6，TSG-6）小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）瞬时转染MSCs，RT-PCR与Western blot检测TSG-6-siRNA在MSCs中、ELISA检测MSCs-CM中的干扰效果。腹膜刮伤后24h将MSCs、TSG-6-siRNA MSCs通过尾静脉注射入大鼠体内；在腹膜刮伤后24h、3d、5d将MSCs-CM、TSG-6-siRNA MSCs-CM或重组小鼠TSG-6（recombinant mouseTSG-6，rmTSG-6）通过尾静脉注射入大鼠体内三次。术后14d，采用腹膜粘连评分观察腹膜粘连的严重程度，Masson三色染色观察纤维化程度。体外利用Transwell共培养系统，通过计算细胞迁移速度、免疫荧光分析E-Cadherin及PCNA，观察MSCs、TSG-6-siRNA MSCs及rmTSG-6对划伤RPMCs修复的影响。MSCs减轻慢性腹膜纤维化的研究：建立慢性腹膜透析诱导的SD大鼠慢性腹膜纤维化模型。在开始腹膜透析液（4.25%）注射后不同时间点，将5×106MSCs通过尾静脉注射入大鼠体内，28d采用Masson三色染色观察腹膜纤维化程度，明确MSCs治疗的最佳时间点。开始腹膜透析液注射的即刻将5×106MSCs通过尾静脉注射入体内。28d检测腹膜超滤功能及葡萄糖转运量，采用Masson三色染色观察腹膜纤维化程度，HE染色观察腹膜血管密度，免疫组化分析腹膜区域PMCs（E-Cadherin）、肌成纤维细胞（smooth muscle actin α，α-SMA）数量及TGF-β1表达。结果：术后24h经尾静脉注射MSCs能减轻急性腹膜粘连程度，MSCs治疗组腹膜粘连评分低于对照组，而腹腔注射疗效不理想；MSCs治疗组在术后反应活跃期的炎症细胞浸润及渗出减少，成纤维细胞数量及TGF-β1水平减少，6d胶原纤维较少、厚度较薄、质地较稀疏；反应活跃期间皮细胞的数量增多、增殖活性增强。与MSCs共培养组细胞在划伤后1h、2h的迁移速度增加，细胞的增殖在划伤后3h开始增加，6h达到高峰，较对照组前移了6h。经尾静脉注射的MSCs主要在肺脏积聚，高峰在4h，荧光信号持续至少7d；经腹腔注射的MSCs则主要在脾脏、肝脏积聚，高峰在24h，持续至少7d；但均未见到损伤腹膜区域内有明显的细胞积聚，甚至在SCID小鼠中经腹腔注射仍未见腹膜区域内有明显的细胞积聚。双光子显微镜及免疫荧光分析显示，尾静脉注射MSCs后4h，肺脏间质中可见散在“栓子样”MSCs，24h肺脏MSCs数量明显下降，但7d肺脏中仍可见少量MSCs，且多数未被巨噬细胞吞噬；经腹腔注射MSCs后4h，脾脏中可见少量MSCs，且多数被巨噬细胞吞噬，24h后MSCs碎片明显增多。尾静脉注射无血清MSCs-CM能减轻急性腹膜粘连的程度，并与MSCs的疗效相似。抗体芯片分析显示，TSG-6因子的分泌在无血清饥饿MSCs的24h内明显增加。经尾静脉注射12h内，在肺脏积聚的MSCs表达TSG-6，且尾静脉注射MSCs4h，大鼠血清TSG-6的水平明显升高，而经腹腔注射在脾脏积聚的MSCs不表达TSG-6，且血清TSG-6水平与对照组无差异。干扰TSG-6的表达、降低其分泌后，肺脏积聚留的MSCs无明显TSG-6表达，血清TSG-6的水平无明显升高，且TSG-6-siRNA MSCs、TSG-6-siRNA MSCs-CM对腹膜粘连的治疗作用、TSG-6-siRNA MSCs对划伤RPMCs迁移或增殖的促进作用均减弱。而单独采用rmTSG-6可以减轻腹膜粘连程度、促进划伤RPMCs的迁移及增殖。腹膜透析液开始注射后即刻经尾静脉注射MSCs能明显减轻慢性腹膜纤维化程度。28d后MSCs治疗组腹膜超滤量、葡萄糖转运量与正常组无差异，腹膜血管密度低于对照组，而腹膜化程度轻于对照组。7d后MSCs治疗组腹膜区域间皮细胞数量多于对照组，21d、28d肌成纤维细胞数量少于对照组，而28dTGF-β1水平低于对照组。结论：经静脉注射的MSCs能够促进RPMCs迁移与增殖能力、抑制炎症细胞浸润、减少成纤维细胞数量、下调TGF-β1水平，从而促进腹膜损伤、减轻急性纤维化；MSCs的治疗作用不是通过定植，而是通过在肺脏中积聚并分泌TSG-6入血的远隔作用方式来实现的。MSCs尚可抑制由腹膜透析液诱导的PMCs发生EMT，减轻慢性腹膜纤维化、改善腹膜超滤功能。