研究背景和目的肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,每年新发现的病人约70万,其中半数发生在我国。发病率高、死亡率高及有效治疗手段的缺乏使深入研究肝癌发病机制、探寻防治新靶点显得极为迫切。绝大多数肝癌病人都有肝纤维化、肝硬化的病史。而肝纤维化是肝脏损伤的一种高度保守的反应,发生在几乎所有与肝细胞死亡相关的疾病中。肝纤维化的病因包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、酒精性脂肪肝、胆汁阻塞性疾病和肝脏自身免疫性疾病等。肝纤维化是一个多细胞反应性疾病,其中肝星状细胞发挥最主要的作用,产生约90%的细胞外基质。肝纤维化晚期发展为肝硬化,而肝硬化具有很高的癌变风险,相当一部分最终发展为肝癌。因此,探寻肝纤维化的治疗手段和发现新的干预靶点具有同样重要的临床意义。HLF(Hepatic Leukemia Factor)的发现源于E2A-HLF融合基因的克隆。E2A-HLF是由t(17;19)(q22;p13)易位形成的融合基因(19号染色体短臂13区的E2A基因与17号染色体长臂22区的HLF基因融合),最早发现于儿童前体B细胞急性淋巴细胞白血病(B cell precursor acute lymphoblastic leukemia);当时通过Northern-blot检测发现,HLF的表达仅限于肝细胞和白血病细胞中,因此将其命名为肝细胞白血病因子。后续的研究还发现,HLF属于脯氨酸和酸性氨基酸含量丰富的碱性亮氨酸拉链(proline and acidic amino acid-rich basic leucine zipper,PAR bZIP)转录因子家族成员；该转录因子家族另外两个成员是白蛋白-D位点结合蛋白(albumin D-site-binding protein, DBP)和毒性当量因子(thyrotroph embryonic factor,TEF)。HLF通过形成同型二聚体或与其他PAR bZIP家族成员形成异型二聚体的方式,结合靶基因启动子区特异的DNA序列并激活转录。PAR bZIP转录因子家族与细胞的生物节律密切相关。研究表明,PAR bZIP家族蛋白DBP、TEF和HLF的同时缺失,会导致小鼠寿命缩短,出现心肌肥大、低血压、低醛固酮等症状,并易发生癫痫而死亡。前期研究发现HLF与造血干细胞的分化和功能有关,在造血系统的恶性肿瘤中发挥重要的作用,同时它还参与肝脏的代谢。但HLF在肝纤维化和肝癌中的作用未见报道。因此,本课题将系统研究HLF在肝纤维化和肝癌发生发展中的作用及分子机制,并结合临床资料探讨其作为肝纤维化和肝癌干预靶点及预后标志物的可行性。研究方法：1.鉴定并繁殖HLF组成性转座敲除小鼠,建立CCl4及胆管结扎诱导的小鼠肝纤维化模型,与对照组比较,研究HLF调控肝纤维化的作用；2.利用HLF转座敲除小鼠建立DEN诱导的小鼠肝癌模型,通过与对照组小鼠相比较,研究HLF调控肝癌发生的作用；3.构建过表达和干扰HLF的质粒,并利用慢病毒系统建立稳定过表达及干扰HLF的肝癌细胞系SMMC-7721 micro -HLF、MHCC-LM3 micro -HLF、97H micro-HLF、SMMC-7721 flag -HLF、MHCC-LM3 flag -HLF及其对照细胞系；4. SMMC-7721 micro -HLF、MHCC-LM3 micro -HLF、97H micro -HLF、 SMMC-7721 flag -HLF、MHCC-LM3 flag -HLF及其对照细胞系分别采用CCK-8实验、细胞周期检测、平板克隆实验、划痕实验、Invasion chamber迁移和侵袭实验观察过表达及干扰HLF后对肝癌细胞生长和转移等生物学特性的影响；5.将MHCC-LM3 micro -HLF及其对照细胞分别接种裸鼠皮下,观察HLF对肝癌细胞体内增殖能力的影响；6.将97H micro -HLF、MHCC-LM3 flag -HLF及其对照细胞分别进行裸鼠尾静脉注射,建立小鼠肝癌肺转移模型,观察HLF对肝癌细胞体内转移能力的影响。7.分离HLF组成性转座失活小鼠及对照小鼠原代肝星状细胞,利用CCK-8实验、划痕实验等方法观察HLF对肝星状细胞活化的影响;8.构建过表达HLF的腺病毒,感染人肝星状细胞系LX-2,采用CCK-8实验、细胞周期检测、Transwell实验等方法,观察过表达HLF对肝星状细胞增殖、迁移、分泌等生物学特性的影响；9.利用Realtime-PCR, western-blot、免疫共沉淀、表达谱芯片、ChIp-seq等方法研究HLF对c-Jun、p21和IL-6/STAT3及PTEN/Akt等信号通路的调控；10.利用RT-PCR, western-blot及免疫组化等方法检测肝纤维化临床样本中HLF的表达情况并运用统计学方法分析HLF的表达与临床病人肝纤维化程度的相关性；11.利用RT-PCR, western-blot及免疫组化等方法检测肝癌临床组织样品中HLF的表达情况并运用统计学方法分析HLF的表达与临床病理和预后资料的相关性。研究结果：1.以CCl4和胆管结扎诱导的小鼠肝纤维化为模型,我们研究发现与野生型小鼠相比较,HLF敲除小鼠的肝纤维化明显减轻。2.分离原代小鼠肝星状细胞进行试验我们发现,与野生型小鼠相比HLF敲除小鼠肝星状细胞的增殖、迁移和分泌能力显著下降。3.将表达HLF的腺病毒感染肝星状细胞后进行RT-PCR、western blot和免疫组化检测发现,HLF可通过调控IL-6/STAT3信号通路促进肝纤维化。4.机制研究的结果还发现,肝星状细胞中HLF的表达受TGF-3调控。5.通过对带有详细病理资料的人肝纤维化组织进行HLF的western-blot及免疫组化检测并评分发现,HLF的表达与肝纤维化的程度呈正相关。6.利用经典的DEN诱癌模型我们发现,HLF敲除组小鼠肝癌发生率明显降低,形成肿瘤的数量和体积也显著低于对照组小鼠,提示HLF对肝癌发生具有促进作用。7.通过对DEN诱癌小鼠的肝癌与癌旁组织进行表达谱芯片分析发现,与对照小鼠相比,HLF敲除小鼠的肝脏癌组织中AP-1家族的表达差异最大,western blot检测的结果验证了这一发现,这提示HLF可能通过调控c-Jun促进肝癌的发生。8.在肝癌细胞中过表达或干扰HLF后进行增殖、周期、平板克隆形成及裸鼠荷瘤实验发现,HLF可促进肝癌细胞增殖和裸鼠成瘤能力。9.在肝癌细胞中过表达或干扰HLF后进行划痕实验、Transwell、Invasion chamber、裸鼠肺转移检测,结果发现HLF可促进肝癌细胞的体内外迁移和侵袭的能力。10.通过对过表达HLF肝癌细胞系及其对照细胞系进行免疫共沉淀、westernblot蛋白电泳、RT-PCR以及裸鼠皮下荷瘤及裸鼠肺转移灶上的免疫组化染色分析发现,HLF可通过调控p21信号通路促进肝癌细胞的增殖,通过调控PTEN/AKT信号通路促进肝癌细胞的转移。11.从核酸及蛋白水平验证了HLF在肝癌组织中的表达高于癌旁,在肝癌转移灶中进一步升高,提示HLF与肝癌转移相关。12.通过对带有详细临床病理资料和预后信息的肝癌组织进行HLF的Western-blot及免疫组化检测并评分,经统计分析发现肝癌中HLF表达越高,患者总体生存期和无瘤生存期越短,提示HLF可能是一个潜在的肝癌预后标志物。结论：本项研究证实HLF对肝纤维化具有显著的促进作用,机制研究表明HLF可上调肝星状细胞中IL-6/STAT3信号通路促进肝星状细胞的活化,进而促进肝纤维化的进程。我们的研究还证实星状细胞中HLF的表达受到细胞外TGF-β调控。临床相关研究结果发现HLF的表达与患者肝纤维化程度相关。利用经典的小鼠DEN诱癌模型我们证实HLF对肝癌发生具有显著的促进作用,可能通过上调癌蛋白c-Jun的表达促进肝癌的发生。HLF对肝癌进展的体内外研究证实HLF可通过下调p21促进肝癌的生长,通过调控PTEN/AKT信号通路促进肝癌转移。临床相关研究证实肝癌组织中HLF表达显著升高,在肝癌转移灶中其表达更高；HLF表达水平与肝癌患者预后密切相关,提示HLF高表达预示着肝癌患者预后不良。综上所述,HLF在肝纤维化和肝癌的发生发展进程中起到了重要的促进作用,可能是肝癌新的预后标志物和潜在的治疗靶点。