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琼胶酶是一种能够降解琼胶,生成琼胶寡糖的糖苷水解酶。近年来,随着糖生物学的深入研究,人们发现琼胶寡糖尤其是新琼寡糖在诱导细胞调亡、抗氧化、抗炎、促进双歧杆菌生长、预防糖尿病等方面具有显著的生理活性,因此可广泛应用在食品、饲料、化妆品和医药领域。琼胶寡糖制备方面,传统的化学酸解法方法存在着反应条件难控制、降解产物不纯等问题,而酶解法则有底物专一性强、产物特异性高、反应条件温和等优点,因此对琼胶酶的研究具有重要意义。本文以本实验室分离得到的海洋细菌HQM9T为主要研究对象,完成了其新种鉴定、发酵产酶条件优化以及琼胶酶基因的克隆表达等工作。海洋细菌HQM9T分离自生长在威海海域的收集的石花菜表面,是一株具有很强琼胶降解能力细菌,在2216E平板上培养3-5天可完全液化平板。HQM9T的呼吸醌类型是MK-6,主要脂肪酸类型是C15:0ISO, C17:0iSO3OH, C16:1w7c/15iSO2OH, C16:03OH, C16:0, C17:02OH, C14:0, C13:1AT12-13, C13:0iso.主要的极性脂包括磷脂酰乙醇胺和一种未知的脂质。基因组DNA(G+C)含量是33.20mol%。16S rDNA的测序结果表明该菌属于拟杆菌门(Bacteroidetes)黄杆菌纲(Flavobacteria)黄杆菌科(Flavobacteriaceae),与该科中明确鉴定到种的Aquimarina agarilytica ZCI有最大相似性,为97.09%,可以初步判别为Aquimarina属的新种,命名为噬琼胶海水菌Aquimarina agarivorans,16S rRNA基因序列的GenBank收录号是HQ593612.本文对其发酵产酶的条件进行了优化,前期研究实验确定了其发酵产酶的基本条件：最适盐度25%o,初始pH为8.0,附加碳源为琼脂,氮源为蛋白胨。在此基础上我们对培养基琼脂、蛋白胨、酵母粉的添加量,装瓶量,接种量,发酵温度,发酵时间等设计七因素三水平的正交实验(L1837),获得该菌产琼胶酶的最佳培养基配方和培养条件为：琼脂0.5%,蛋白胨0.6%,酵母粉0.08%, NaC125%o,初始pH8.0,装瓶量50ml(250ml三角瓶),温度28℃,接种量0.1%情况下,150rpm/min培养发酵72h测得最大酶活,可稳定在35U.ml-1左右,较优化前提高了大约2倍。为了更好地对细菌HQM9T的琼胶酶进行研究,对其全基因组进行了测序。将HQM9T全基因组测序结果与相关蛋白数据库(包括KEGG, Swissprot, Uniprot等)中已知琼胶酶基因进行比对,发现该菌株含有36个预测的琼胶酶基因,其中19个属于GH16家族,其余的不属于已知家族,基因长度从309bp-5217bp,表明菌株及其琼胶酶具有新颖性。对HQM9T发酵后的粗酶液进行活性电泳检测,结果表明在HQM9T的粗酶液能够检测到琼胶酶组分。质谱鉴定的分析结果表明这七个酶组分分别为基因aga16A, aga16I, aga16L, aga16S, aga16AB, aga16AD, agaAJ编码的琼胶酶,其分子量大小分别为96.68kDa,128.19kDa,72.91kDa,98.88kDa,44.35kDa,57.61kDa,73.98kDa。选取pET原核表达系统对质谱鉴定的7个琼胶酶基因进行克隆表达。将此七条基因连入pET-24a(+)原核表达载体,转入宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)中构建重组菌株。经过IPTG诱导后,SDS-PAGE检测表明转入基因aga16AD的重组表达菌株有大量符合预期大小的蛋白表达,且在菌体破碎上清中能够检测到琼胶酶活性,其他的重组菌株未有明显蛋白的表达。通过镍离子亲和层析,对重组琼胶酶进行分离纯化,SDS-PAGE检测为电泳纯。对纯化之后的重组酶的酶学性质进行了检测分析,发现重组酶的最适底物浓度为1%,最适温度为50℃,最适pH为6.0。不同的金属离子对重组酶的影响不同,Ca2+以稍微提高重组酶的酶活,K+、Mg2+和Na+对重组酶酶活几乎无任何影响,而Zn2+、Mn2、+Cu2+、Co2+和Pb2+等重金属离子,对重组酶酶活有较大的抑制作用。对其它基因进行pMAL蛋白融合表达,SDS-PAGE检测表明重组蛋白的分子量都符合预期。但是对诱导后的菌液破壁之后,琼胶酶活性检测反应均为阴性,原因可能为在周质空间里表达的重组蛋白,与麦芽糖结合蛋白融合表达之后,没有获得正确折叠,形成特定的空间结构,无法与底物正确结合。