研究目的:高发病率、不理想的预后、缺乏特异的生物标志物及个性化用药困难等因素导致胃癌已成为全球癌症死亡的第二大原因。胃癌通常诊断较晚,化疗是进展期胃癌患者的主要治疗手段。约30%的癌症发生RAS突变,KRAS突变是胃癌中发生频率最高的RAS突变,发生率约为11%。KRAS突变会过度激活MEK-ERK信号通路,诱导细胞周期关键调控蛋白CDK和Cyclin D1激活,促进肿瘤细胞过度增殖,导致细胞周期进程的调控紊乱。直接靶向抑制KRAS治疗胃癌的疗效难以达到预期,靶向抑制KRAS下游因子MEK导致ERK磷酸化及Cyclin D表达增加,促进了肿瘤细胞的增殖和细胞周期的紊乱。CDK4/6是细胞周期的核心驱动因子,抑制CDK4/6可能会激活MAPK信号通路。联合靶向CDK4/6和MEK可以协同高效抑制胃癌细胞周期紊乱及MAPK信号通路的激活,有效地遏制胃癌细胞的增殖。目前,临床试验报道CDK4/6抑制剂联合MEK抑制剂在神经母细胞瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌和黑素瘤等肿瘤具有显著的协同抗肿瘤效果,但关于KRAS突变型胃癌的实验治疗效果尚不清楚。细胞衰老在肿瘤生长和增殖扮演重要的生理调控功能,可能在抑制肿瘤细胞增殖过程中发挥重要作用。该研究报道MEK抑制剂联合CDK4/6抑制剂对KRAS突变型胃癌衰老的影响,以期为胃癌的精准治疗提供新的策略。研究方法:1.免疫组化染色检测CDK6在胃癌组织和癌旁组织的表达,Western Blot和RT-qPCR检测CDK6在胃上皮细胞和胃癌细胞中的表达。GEPIA数据库研究CDK4和KRAS在胃癌中的表达。根据Kaplan-Meier plotter来源于TCGA、EGA和GEO数据库的875例胃癌患者的生存信息,分析CDK6、CDK4和KRAS表达对胃癌患者预后的影响。2.CCK-8实验筛选药物对胃癌细胞抑制的浓度和联合药物使用的浓度;克隆形成实验观察药物对胃癌细胞克隆形成的影响;流式细胞术检测药物对胃癌细胞增殖的影响;Transwell侵袭迁移实验和划痕实验观察药物对胃癌细胞侵袭和迁移的影响;β半乳糖苷酶染色观察药物对胃癌细胞衰老的影响;利用小管形成实验观察药物对胃癌细胞血管环形成的影响。3.Western Blot 检测 MEK 抑制剂 Trametinib 和 CDK4/6 抑制剂 Palbociclib 联合对 p53、p21、p-MEK、MEK、和CDK6蛋白表达的影响。4.MKN1胃癌细胞荷瘤构建BALB/c裸鼠模型。随机对裸鼠分组,设置4个组别:对照、Trametinib（3 mg/kg）、Palbociclib（150 mg/kg）和 Trametinib（3 mg/kg）联合Palbociclib（150 mg/kg）,每周连续4天灌胃给药,停药3天,隔天记录肿瘤的大小和裸鼠的体重。第21天处死裸鼠,获取裸鼠的肿瘤组织。研究结果:1.CDK4、CDK6和KRAS在胃癌中过表达,预示着患者不良预后。2.MEK抑制剂和CDK4/6抑制剂联合使用可以显著抑制KRAS突变型胃癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭、迁移和血管环形成,促进KRAS突变型胃癌细胞的衰老。3.MEK抑制剂和CDK4/6抑制剂联合使用可以显著提高p53、p21、p-MEK的表达水平、显著降低CDK6的表达,但对MEK的表达水平几乎没有影响。4.MEK抑制剂和CDK4/6抑制剂联合使用在体内可能协同抑制胃癌的生长。结论:MEK-CDK4/6双靶点抑制剂对KRAS突变型胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移和血管形成具有协同抑制作用,且可能通过上调p53和p21诱导了 KRAS突变型胃癌细胞的衰老。