论文部分内容阅读
本研究在克隆鲤，IGF-ⅠⅡ和IGF-Ⅱ的基础上，运用大肠杆菌原核表达系统和毕赤酵母真核表达系统对鲤IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的基因工程表达进行了研究。
1.运用RT-PCR技术，从鲤肝脏总RNA中扩增出IGF-Ⅰ成熟肽cDNA序列，IGF-Ⅱ前肽cDNA序列，连接至pMD18-T载体，测序结果表明，与已报道的序列相比，克隆的鲤IGF-Ⅰ与其完全相同，IGF-Ⅱ基因有1个位点发生同义突变。
2.构建原核表达载体pGEX-KG-IGF-Im和pET-32a-IGF-Ⅱm，重组质粒转化大肠杆菌BL21并进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳分析，重组菌可表达分子量分别约为34kDa和28kDa的重组蛋白，且目的蛋白主要以包涵体的形式存在，经0.3mmol/LIPTG诱导3h后，表达量均出现最高，占菌体总量的30％～35％。提取包涵体，并进行SKL变性及透析复性处理，由此初步纯化了原核重组蛋白IGFs。
3.以初步纯化的原核重组蛋白IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ为抗原，分别免疫新西兰大耳兔，制备了兔抗鲤IGF-Ⅰ/IGF-Ⅱ抗血清。抗血清经间接ELISA检测效价结果，Western-blot显示抗血清均能与重组蛋白发生特异性反应。
4.构建酵母表达载体pPIC9K-IGF-Ⅰm，LiCl法转化巴斯德毕赤酵母菌。经表型分析、G418筛选及PCR鉴定，得到His<+>Mut<+>型抗2.0 mg/mLG418的多拷贝转化子。以0.5％甲醇诱导培养，Dot-Blot及Tricine-SDS-PAGE电泳显示培养上清含大小约7.5kDa的重组IGF-Ⅰ蛋白，在诱导3d后，表达量最高。Western-blot分析表明，此真核表达蛋白能与兔抗IGF-Ⅰ多克隆抗体发生特异性免疫反应。