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丹参-人参组分复方（The optimal component formula,OCF）源自课题组前期正交设计筛选的丹参、人参中抗乳腺癌的活性成分,其组成为丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖,配比为5 mg/L、10mg/L、5mg/L。前期研究成果表明OCF能显著降低肺癌A549细胞的迁移侵袭能力,对乳腺癌MCF-7细胞也有较强的增殖抑制和诱导凋亡作用[1]。而三阴性乳腺癌是乳腺癌中恶性程度最高和侵袭性最强的一种,占所有乳腺癌的12-1 7%[2]。本文主要对OCF和顺铂对三阴性乳腺癌的联合作用进行初步研究。研究目的:在既往课题组研究的基础上,观察研究OCF和DDP对三阴性乳腺癌细胞的联合作用。研究方法:1.三阴性乳腺癌差异表达基因的识别和筛选:以“TNBC”作为检索词,在GEO数据库中筛选一系列mRNA微阵列数据集。从TCGA数据库中获取乳腺癌和正常乳腺组织的mRNA测序数据及其对应患者的临床信息。使用肿瘤纯度估计和主成分分析（PCA）评估数据样本的肿瘤纯度并区分样本来源。然后使用limma软件包进行差异表达矩阵采集和差异表达基因分析。在TCGA中进一步验证这些差异表达基因,并将这些差异表达基因聚类并通过热图进行可视化绘制。通过plotROC软件包来分析上述被验证后的差异表达基因,以预测其鉴别正常组织和三阴性乳腺癌以及鉴别三阴性乳腺癌和非三阴性乳腺癌的能力。2.三阴性乳腺癌差异表达基因的预后分析:使用R软件中的生存数据包进行三阴性乳腺癌差异表达基因的单因素风险回归分析,基于这些符合条件的差异表达基因,建立无病间隔（disease-free interval,DFI）和无进展间隔（progression-free interva,PFI）的多因素风险回归模型。采用ROC曲线验证DFI和PFI的多因素风险回归模型的预测准确性。最后,采用RMS软件包将临床信息整合到多因素风险回归模型中,并通过ROC曲线分析计算模型的准确性和特异性。3.使用qRT-PCR技术检测三阴性乳腺癌差异表达基因的表达水平以验证生物信息学分析的结果。4.使用分子对接技术探讨丹参、人参活性成分与三阴性乳腺癌差异表达靶基因的亲和力水平。5.（1）使用MTT法检测不同浓度条件下OCF和DDP单药及联合作用三阴性乳腺癌48h的抑制率,利用Chou-Talalay法评价药物联合效果,筛选出抑制增殖效果最好的三阴性乳腺癌细胞以及最佳药物浓度组合;（2）克隆形成实验检测OCF和DDP单药及联合对三阴性乳腺癌细胞增殖能力的影响;（3）经典划痕实验检测OCF和DDP单药及联合对三阴性乳腺癌细胞迁移能力的影响;（4）Transwell实验检测OCF和DDP单药及联合对三阴性乳腺癌细胞迁移能力的影响;（5）通过qRT-PCR方法检测OCF和DDP单药及联合对三阴性乳腺癌细胞差异表达基因表达的影响。结果:1.三阴性乳腺癌差异表达基因的识别和筛选结果:在GEO数据库中筛选得到2个mRNA微阵列数据集:GSE115275和GSE62931。对来自TCGA和GEO数据集的数据进行过滤,最终将120个正常组织样本、176个TNBC样本和916个non-TNBC样本纳入本研究。采用肿瘤纯度估计和主成分分析方法对1092例乳腺癌组织样本的肿瘤纯度进行了评估,肿瘤纯度在0.159至0.994之间,有56.4%的肿瘤样本的纯度大于平均值0.741,并且所选数据集可以准确区分对照组和TNBC组。差异表达基因分析显示:从GSE115275中获得了 TNBC和正常乳腺组织之间的2158个差异表达基因,其中包括1291个上调基因和867个下调基因,从GSE62931中获得了 TNBC和non-TNBC之间的1170个差异表达基因,其中包括558个上调基因和612个下调基因。经TCGA数据库验证后,共筛选出TNBC与正常乳腺组织相比的差异表达基因991个（482个上调基因,509个下调基因）,在TNBC和non-TNBC之间进行筛选,共获得997个差异表达基因（491个上调基因,506个下调基因）。取两部分差异表达基因的交集,共得到125个共同差异表达基因,这些基因可能在TNBC中起关键作用。plotROC软件包来分析上述被验证后的差异表达基因,其中121个差异表达基因可以准确区分正常乳腺组织样本和TNBC样本,而其中109个差异表达基因可以准确区分non-TNBC样本和TNBC样本。取上述121个差异表达基因和109个差异表达基因的交集,最终获得105个可以识别TNBC样本和对照组的TNBC差异表达基因。根据正常组织和TNBC组织AUC值排序,排名前5的基因分别是AURKA、ADAM33、CDCA8、CDCA3和NUF2。2.三阴性乳腺癌差异表达基因的预后分析结果:构建单因素风险回归模型,根据ROC分析结果分析差异表达基因的DFI和PFI,最终得到9个异质相关基因被认为是影响预后的因素（P＜0.05）,其中4个基因（FAM83B、KITLG、CFD和RBM24）与TNBC患者的DFI 显著相关（n=109）,5 个基因（FAM83B、EXO1、S100B、TYMS 和 CFD）与 TNBC患者的PFI显著相关（n=120）。对上述9个基因进行多因素风险回归分析,根据DFI的中位风险得分将患者分为高风险组和低风险组,结果表明,死亡人数随着风险得分升高而增加。在DFI模型的高危组中,KITLG和RBM24为上调基因,FAM83B为下调基因。在PFI模型的高危组中,FAM83B和S100B为下调基因。ROC曲线评估DFI和PFI的多因素风险回归模型的预测性能,显示其预测性能良好。3.qRT-PCR技术检测三阴性乳腺癌差异表达基因的表达水平结果:与正常乳腺细胞MCF-10A相比,FAM83B在MDA-MB-231中低表达,与非三阴性乳腺癌细胞MCF-7相比,FAM83B也是低表达;与正常乳腺细胞MCF-10A相比,KITLG在MDA-MB-231中高表达,这与生物信息学结果一致。4.分子对接技术探讨丹参、人参活性成分与三阴性乳腺癌差异表达靶基因的亲和力水平结果:分子对接分析中,我们分别对丹参-人参中共261个化学成分的1713个化学成分的靶点进行分子对接模拟,发现丹参、人参活性成分与三阴性乳腺癌预后相关基因FAM83B、RAM24、KITLG、S100B的结合区域较多,说明丹参、人参中的化合物与预后相关基因的分子生物亲和力较高,可能具有较高的药效活性。5.（1）MTT实验结果:OCF对大多数三阴性乳腺癌细胞有较明显的抑制作用,且抑制作用与药物浓度存在正相关关系,而对正常乳腺细胞毒性较小。在作用48h后,不同浓度的DDP对三阴性乳腺癌细胞均表现出较强的抑制作用,且呈浓度依耐性。利用Chou-Talalay法评价药物联合效果,筛选出抑制增殖效果最好的细胞为MDA-MB-231和4T1,最佳药物浓度组合为0.5 OCF+1 ug/mlDDP;（2）克隆形成实验结果:与对照组相比,单药组和联合组三阴性乳腺癌细胞克隆形成数量显著降低,与单药组相比,联合组的克隆形成数目明显减少;（3）经典划痕实验结果:就MDA-MB-231而言,与对照组相比,OCF和DDP单药及联用组24h和48h的细胞迁移率均明显降低,可见各个组别都能显著抑制MDA-MB-231的迁移能力,但与单药组相比,OCF和DDP联药组的细胞迁移率没有明显降低。就4T1而言,在作用48h后,各个给药组均能显著抑制4T1的迁移能力,并且联合用药组抑制4T1迁移能力的作用强于单药组;（4）Transwell实验结果:OCF和DDP,无论是单药还是联合用药均能显著抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移能力,而且OCF和DDP联用可增强单药抑制其迁移能力的作用;（5）qRT-PCR方法检测OCF和DDP单药及联合对三阴性乳腺癌细胞差异表达基因影响的结果:实验结果阴性,未达预期。结论:OCF和DDP单药及联合可抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和4T1增殖和迁移的能力,两药在0.5 OCF+1 ug/ml的组合下作用48h可产生协同增效作用,但其机制尚不明确。