目前,临床上使用的溶栓药有尿激酶、人组织纤溶酶原激活剂等,纤溶酶原激活剂类溶栓药已经发展到第3代,以重组人纤溶酶原激活剂为代表。重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)是天然t-PA重组突变体,保留了 K2和P区,提高了溶栓效果、纤维蛋白的亲和力特异性高、半衰期延迟、使用剂量减少、全身出血和颅内出血发生率降低等特点。利用乳腺生物反应器生产rhPA,大大提高生产量、目的蛋白质可以在机体内翻译,磷酸化、羧化等修饰,生物活性高,成本低,样品纯化简单等优点。通过沉淀法、超滤法、层析法等技术相结合,有效的从乳汁中分离和纯化到表达蛋白。本实验通过体细胞核移植技术制备了乳腺特异性表达rhPA转基因山羊,重组人纤溶酶原激活剂cDNA在山羊乳腺中特异性表达。通过ELISA、Western Blot,检测rhPA的表达产物分泌到乳汁内;经FAPA检测,表达产物有较高的比活性。rhPA转基因山羊制备:无菌手术取30日龄的羊胎儿,分离提取山羊胎儿成纤维细胞培养,电转染乳腺特异性表达载体BCL14/rhPA基因到胎儿成纤维细胞。用含有G418600μg/mL的细胞培养液筛选7-10天后,挑取单克隆细胞株经PCR检测筛选出阳性细胞株24株,其中选取7株作为供核细胞。用含0.5%FBS的DMEM/F12培养液饥饿72h阳性细胞株作为供核细胞。活体输卵管冲洗法获取MII期的卵母细胞,去核后作为核受体进行体细胞核移植,重构胚移植到同期发情的受体羊输卵管内。30天、60天进行B超检查受体羊的妊娠情况,出生的小羊PCR检测是否整合rhPA基因。超数排卵供体羊42只,获得MII期卵母细胞438枚,受体羊26只,移植重构胚256枚,7只受体羊妊娠,其怀孕率为26.9%,出生2只小羊,提取基因组进行PCR检测为rhPA转基因山羊(BP21、BP22)。获得的转基因山羊进行饲养、性成熟后,与正常公羊配种、妊娠、分娩,出生的小羊提取基因组,PCR检测为rhPA转基因山羊。收集乳汁,高速离心取乳清,ELISA免疫原性检测,半定量分析转基因山羊乳清中rhPA表达量约是92.2μg/mL。SDS-PAGA电泳和Western Blot检测克隆羊乳清,出现了约39kD大小的特异性目的条带。FAPA与ELISA检测结合显示,BP21转基因羊乳清中所含rhPA的比活性大约为阿替普酶的40倍。表达产物rhPA的分离和鉴定:羊乳经过超速离心、酸碱沉淀去除脂肪和酪蛋白后,上样到赖氨酸亲和层析株进行分离和纯化。SDS-PAGA电泳和Western Blot检测有纯化样品中有39kDa的特异性目的条带,FAPA检测具有溶栓活性,说明羊乳经过L-赖氨酸亲和层析纯化后依然具有溶栓活性。本实验利用体细胞核移植技术获得转rhPA山羊,乳汁中rhPA特异性表达含量为大约73.6μg/mL,具有高比活性。表达产物能够通过L-赖氨酸亲和层析分离和纯化出来,纯化产物回收率高、生物学活性高,为后续进一步纯化奠定基础。目前未见关于重组人纤溶酶原激活剂在山羊乳腺上表达的相关报道。