静宁鸡属于甘肃省特有的地方鸡种,肉蛋兼用,目前已经处于濒临灭绝的状况。静宁鸡与肉鸡具有相同的起源,具有大体相同的遗传背景,但也存在与其特定性状如肌肉生长发育相关的差异。本论文以静宁鸡鸡胚为主要研究对象,选择生长发育相关蛋白：猫眼综合症候选基因2(CECR2)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)；脂肪酸代谢相关蛋白：细胞外脂肪酸结合蛋白(Ex-FABP)、脂蛋白脂酶(LPL)；蛋白质降解相关蛋白：钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)、钙蛋白酶1(CAPN1)。用免疫组织化学方法观察鸡胚发育HH19-31期后肢芽和体节中以上蛋白的表达分布,Western blotting方法检测静宁鸡鸡胚在HH19、HH24、HH27、HH31各期及孵化13天(E13)、孵化18天(E18)后肢肌肉中以上蛋白的表达水平变化,并与白羽肉鸡、黄羽肉鸡、海兰褐蛋鸡鸡胚中的表达进行比较,旨在了解静宁鸡肌肉生长发育规律,探寻不同发育期参与静宁鸡鸡胚肌肉发育调控的蛋白。结果如下：1行为学、组织学与扫描电镜观察体视显微镜下观察鸡胚各时期的发育特征与Hamburger的分期特征基本一致,可以按期进行取材。从HH19期到HH31期,不同品系鸡胚5min内运动行为有差异,黄羽肉鸡和白羽肉鸡的运动要普遍高于静宁鸡和海兰蛋鸡。鸡胚重量随着孵化天数的增加而增长,但增重程度不一致。成年静宁鸡在肉质特性方面优于黄羽肉鸡。提示不同品种选择的结果可能使得细胞在早期增殖、分化水平上已经发生改变,不同品种间生长速度的差异在胚胎期就表现出来了。2生长发育相关蛋白在静宁鸡鸡胚发育中的表达2.1免疫组化结果发现,CECR2蛋白在不同品系鸡胚发育中的肢芽、体节都有表达。HH19期CECR2在靠近喙端的体节、肢芽边缘区表达；HH21-27期：CECR2表达延伸至尾端体节、肢芽边缘区；HH29-31期：CECR2在体节、肢芽中还有表达。Western blotting结果：白羽肉鸡和黄羽肉鸡肌肉中CECR2蛋白在整个过程一直较高表达,静宁鸡肢芽发育HH19-24期CECR2蛋白几乎不表达,在HH27期时表达突然升高,到13天时已经超过了黄羽肉鸡和白羽肉鸡,而蛋鸡表达变化不大。这表明CECR2蛋白参与了静宁鸡早期肌节发育和肌细胞发生,在不同种鸡各个发育时期出现的时间以及表达的情况都不一致,这可能与不同的肌细胞发育有关。2.2免疫组化结果发现,IGF-1蛋白在不同品系鸡胚中都有表达,细胞内表达部位主要为细胞质。HH19期：IGF-1蛋白在外胚层侧板有表达；HH21-27期：IGF-1在肢芽外胚层顶外胚层嵴、非顶外胚层嵴区、软骨形成区有分布。HH31期：在前软骨雏形区,软骨膜周围,细胞坏死区也出现。Western blotting结果：在静宁鸡肌肉发育过程中,IGF-1蛋白表达水平持续增加,其中在HH27-31期间表达水平最高,从HH31期开始又出现降低,显著低于白羽肉鸡,与黄羽肉鸡的表达相当。以上结果表明肌肉IGF-1蛋白表达存在品系差异,在鸡胚发育中肌原细胞程序性的激活和肌肉特异基因的表达受到IGF-1的影响,IGF-1可能参与调控静宁鸡胚胎肌肉发生中成肌细胞的增殖和肌管融合。3脂肪酸代谢相关蛋白在静宁鸡鸡胚发育中的表达3.1免疫组织化学结果表明,在鸡胚早期发育中,Ex-FABP蛋白在整个肢芽都有分布。在早期,Ex-FABP蛋白在间质细胞中有表达,HH29期时,血管上也有分布。HH31期时,肌细胞上Ex-FABP蛋白表达增多,间质细胞中表达减少。Western blotting结果：静宁鸡在整个过程中Ex-FABP蛋白表达水平均较高,高于同期的肉鸡和蛋鸡。结果表明在胚胎发育初期,静宁鸡体内Ex-FABP蛋白的表达与早期肌肉发育有关系,可能会促进肌肉肌间脂肪的沉积,也可能会作为能量的提供者,在静宁鸡耐寒性状中发挥作用。3.2免疫组化结果发现,LPL蛋白在鸡胚发育中的肢芽和体节均有表达。HH19-31期：LPL蛋白在肢芽外胚层顶外胚层嵴、非顶外胚层嵴区、软骨形成区有分布,脂肪细胞中也有分布。Western blotting结果：在发育的各个时期,静宁鸡LPL蛋白表达一直处于较高的水平,在HH27、31、E18期,表达量最高,与黄羽肉鸡和白羽肉鸡有显著性差异。静宁鸡胚胎肢芽肌肉组织发育过程中LPL的表达总体较高,这一时期主要是器官形成和分化期,可能LPL并不是静宁鸡体内调节肌肉发育的主要因子,它可能更多地与肌细胞的能量需求及肌内脂肪沉积相关,从而提高其在恶劣环境下的生存能力。表达时间上的差异可能是由于静宁鸡LPL基因表达启动早于其它鸡,对静宁鸡早期胚胎发育能量供应效应要高于其它鸡。4蛋白质降解相关蛋白在静宁鸡鸡胚发育中的表达4.1免疫组化结果发现,从HH19-31期,CAST蛋白在肢芽和体节中广泛分布。Western blotting结果：在HH19-24期,静宁鸡CAST蛋白的表达均高于其它三个品系,随后静宁鸡表达下降；第13-18天,静宁鸡表达又升高,与黄羽肉鸡、白羽肉鸡、海兰蛋鸡间差异显著。结果表明钙蛋白酶抑制酶在鸡细胞内是普遍存在的,由于肝脏为优势表达组织,而胚胎期肌肉组织表达不占优势,因而此基因在静宁鸡早期腿肌发育中不是主要的调控因子,可能更多的与嫩度相关。4.2免疫组化研究发现,CAPN1蛋白在鸡胚肢芽发育中均有表达,但是表达量相对较弱。Western blotting蛋白定量：在发育的各个时期,静宁鸡CAPN1蛋白表达一直比较稳定,其中在HH27-HH31期之间表达较高。HH19期到13天之间,静宁鸡CAPN1蛋白表达水平略低于黄羽肉鸡和白羽肉鸡,但高于海兰蛋鸡；到第18天时,静宁鸡CAPN1表达水平略低于白羽肉鸡,高于黄羽肉鸡,和海兰蛋鸡间有显著性差异(p＜0.05)。结果表明CAPN1参与了早期鸡胚肌肉发育。在静宁鸡发育早期中CAPN1蛋白表达水平的变化,可能是满足肌细胞生长发育中对蛋白质新陈代谢的需求；发育后期第13天到第18天中又出现降低,可能是与肉质嫩度有关系。总之,在静宁鸡鸡胚发育中,猫眼综合症候选基因2、胰岛素样生长因子1、细胞外脂肪酸结合蛋白、脂蛋白脂酶、钙蛋白酶抑制蛋白、钙蛋白酶1参与了肌肉发育调控。静宁鸡与白羽肉鸡、黄羽肉鸡、海兰褐蛋鸡在肌肉发育中存在差异,可能是由于不同蛋白对肌肉发育调节能力不同所致。