背景及目的:急性白血病整体治疗效果目前仍不能令人满意,疾病复发与难治是影响疗效进一步提高的两个主要原因。当前分子遗传学异常导致的细胞内部信号转导紊乱被认为是导致急性白血病发病的主要因素,而能够靶向抑制疾病相关信号通路的激酶抑制剂类药物被认为是未来疗效突破的希望[1]。目前,以索拉非尼为代表的多靶点酪氨酸激酶抑制剂已经在难治复发型白血病患者中广泛应用,但患者间疗效存在明显差异,其中原因并不清楚。我们早期研究发现,药物靶点c-kit(CD1 17)高表达者,疗效优于低表达或无表达患者,似乎药物疗效与靶受体表达量密切相关。近年发现,生理状态下酪氨酸激酶信号存在激活与灭活,正负两个调控系统[2],而c-CBL蛋白被认为是酪氨酸激酶信号负性调控的核心[3],其表达下降将直接导致酪氨酸激酶型受体(如:c-kit)信号表达的增强[4]。为此,我们设想c-Cbl基因的表达与细胞耐药之间是否存在一定的联系?调节c-Cbl基因的表达,通过改变酪氨酸激酶正、负调节平衡,是否可以影响白血病细胞的耐药,并由此改变临床患者的疗效?为此,我们进行了c-Cbl基因功能状态与细胞耐药相关研究,并初步探讨了索拉非尼治疗与c-CBL蛋白及其相关信号通路间的关系。方法:1.定量PCR法检测难治、复发患者c-Cbl基因的基础表达2.基因重组技术分别构建可促使c-Cbl基因表达沉默慢病毒载体和过表达腺病毒载体,慢病毒和腺病毒包装,病毒颗粒感染HL60和THP1白血病细胞,定量PCR法和免疫印迹法检测c-Cbl基因在mRNA转录和蛋白翻译层面改变,验证慢病毒和腺病毒包装成功。3.慢病毒和腺病毒分别感染白血病细胞,感染后获得c-Cbl基因沉默和过表达细胞。以普通白血病细胞为对照,利用CCK-8法和台盼蓝拒染技术法检测三种细胞自身增殖、干细胞因子刺激后增殖以及药物敏感性方面的差异。流式细胞仪检测细胞周期以及各细胞对索拉非尼和阿糖胞苷凋亡诱导效应的差异4.免疫印迹检测索拉非尼处理前后,c-Cbl基因沉默、过表达和普通细胞内T-CBL、p-CBL、c-Kit(CD117)、PDGFRβ(CD140b)、MDR1、T-Akt、p-Akt、T-ERK、p-ERK蛋白表达变化。结果:1.难治复发型急性白血病患者普遍存在c-Cbl基因低表达现象2.成功构建并筛选出可以高效感染白血病细胞的慢病毒,病毒感染后,可成功筛选出HL60和THP1细胞c-Cbl基因稳定沉默株。与普通对照细胞相比,c-Cbl基因表达沉默细胞,自身增殖轻度增加,细胞s期比例下降,细胞对SCF刺激敏感性增高,对索拉非尼敏感性下降;索拉非尼和阿糖胞苷直接诱导的细胞凋亡减少。3.成功构建高效感染白血病细胞的腺病毒,病毒感染后,HL60和THP1细胞可检测出c-Cbl基因和蛋白瞬时高表达。与普通对照细胞相比,过表达细胞增殖下降,G2/M期比例下降,细胞对SCF刺激敏感性下降,对索拉非尼敏感性增强,索拉非尼和阿糖胞苷直接诱导的细胞凋亡增加。4.免疫印迹分析显示,索拉非尼处理可导致各细胞T-CBL和p-CBL蛋白均表达下调,c-kit和PDGFRβ不同程度表达上调,MDR1表达无明确影响。沉默c-Cbl基因表达,HL60细胞ERK和AKt双信号通路激活,THP1细胞AKt信号通路激活;c-Cbl基因过表达,两种细胞ERK和AKt通路均无激活。索拉非尼处理普通白血病细胞,HL60细胞ERK通路激活,THP1细胞AKt通路激活;索拉非尼处理c-Cbl基因沉默或过表达细胞株,均可检测到细胞ERK和AKt双信号通路激活。结论:1、c-Cbl基因普遍低表达可能与患者细胞耐药、疾病难治相关2、c-Cbl基因表达下调,细胞自身增殖、配体刺激的增殖增加;细胞对索拉非尼和阿糖胞苷耐药性增高。3、c-Cbl基因表达上调,细胞自身增殖、配体刺激的增殖下降;细胞对索拉非尼和阿糖胞苷敏感性增加。4.c-Cbl基因表达差异与白血病细胞耐药性相关;索拉非尼应用促使c-CBL蛋白表达下调,膜表面靶受体蛋白表达上调。强制改变c-Cbl基因表达,可促使细胞固有信号激活方式发生改变。Akt和ERK两个信号通路蛋白,同时参与了索拉非尼诱导的c-Cbl基因表达变化细胞内部信号的激活。5.以c-Cbl基因功能分析,索拉非尼加重细胞耐药发生,临床使用应谨慎选择适合人群。以临床实际效果分析,大部分患者仍有一定疗效,不排除另有其他通路和机制参与了细胞耐药发生。