研究背景和目的原发性肝细胞癌(Hepatocellular caicinoma,HCC；简称肝癌)是临床上常见的恶性肿瘤,近年来随着乙型和丙型肝炎病毒的感染率在世界范围内的增加,肝癌的发病率也逐渐上升,有报告显示,每年有新发肝癌超过70万例。目前肝癌已成为世界上第五大最常见的恶性肿瘤,肝癌致死率在癌症死亡率中排名第三。只有约15%的肝癌有机会通过手术治愈(例如,肝切除或移植)或微创局部治疗(例如,射频消融)。随着医学影像等技术手段的提高,肝癌的早期诊断和治疗虽取得了巨大进步,但长期预后仍不理想,有学者研究报道,肝癌患者平均的5年生存率仅为8.9%。大多数肝癌是由慢性肝病(如乙肝、丙肝、酒精肝等)发展而来的,但仍有15-50%的新发病例病因不清。肝癌的早期转移是影响其临床预后的一个重要因素,在这一复杂过程中,涉及到多基因、多蛋白的参与。当前对肿瘤发生发展机制的研究大多关注癌基因、抑癌基因、小分子RNA等单个或多个分子的作用和功能,而蛋白质作为基因编码产物,是生命活动的最终执行者,其在肿瘤中的表达、对肿瘤发生发展所起的作用,仍有待阐明。随着分子生物学及蛋白质组学技术的发展,在细胞内执行生物学功能的蛋白质又重新得到重视,蛋白质分子间的相互作用作为蛋白质组学研究的主要内容之一已成为近年来的研究热点。蛋白质之间的相互作用不但能够提供蛋白质本身功能的信息,而且能够提供蛋白质在代谢调控、信号传导和复合体中起作用的信息,这为揭示肿瘤发生发展机制带来了新的希望。锌指蛋白具有指状结构,常出现在DNA结合蛋白中,属于真核转录因子的一大家族,锌指蛋白结构域有胱氨酸和组氨酸残基以及锌离子构成。根据锌离子与这两种氨基酸的组合方式,锌指蛋白可以分为C2H2、C3、C4等多种类型。许多锌指蛋白除了能够识别特定的DNA序列,还参与蛋白质与RNA和蛋白质-蛋白质相互作用。本研究中的HSPC238蛋白,其基因组全长716个碱基,编码153个氨基酸,其第40至60氨基酸残基能够形成特殊的RING指结构域,故也是一种C3HC4型锌指蛋白。本课题组在前期研究中发现HSPC238蛋白是一种新的抑癌蛋白。我们通过对139例具有完整临床随访资料的肝癌组织标本进行了免疫组织化学检测,结果显示：HSPC238蛋白在正常肝组织中的表达水平显著高于肝癌组织,与肝癌患者的年龄、性别及临床分期无相关性,但与肝癌的分化程度呈负相关；在体外培养的SMMC7721细胞系中改变HSPC238的表达,结果发现,上调HSPC238的表达可抑制SMMC7721细胞株的增殖和克隆形成,下调HSPC238的表达可促进SMMC7721细胞株的增殖和克隆形成；进一步通过体内裸鼠成瘤实验证实,上调HSPC238可抑制裸鼠体内肿瘤细胞的增殖,干扰HSPC238的表达则可促进裸鼠体内肿瘤的增殖；进一步深入研究发现,HSPC238通过ERK/MAPK途径对肝癌细胞发挥抑制作用。这些前期研究结果为探索肝癌抑癌机制及寻找新的肝癌诊断潜在标志物提供了新的理论依据和研究靶点。除上述研究结果外,国内外尚无对HSPC238蛋白与肝癌功能的相关报道,为进一步深入研究HSPC238在肝癌中的抑癌作用机制,本实验拟通过酵母双杂交系统筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白,并进一步通过激光共聚焦、免疫共沉淀及pull-down等实验技术对筛选到的目标蛋白进行验证,从而为全面研究HSPC238的功能及其在肝癌中的作用机制奠定基础。方法：1.重组诱饵质粒载体的构建、酵母转化及自激活检测1.1重组诱饵质粒载体的构建将装载了人工合成的目的基因HSPC238的质粒载体(pUC19-HSPC238质粒,前期研究中制备并保存)通过转化大肠杆菌Top10感受态细胞进行扩增和质粒抽提,以获取足量的目的基因片段；所得质粒(pUC19-HSPC238质粒)经电泳、测序等方法鉴定后与酵母双杂交诱饵载体质粒pGBKT7双酶切后连接,初步获得含诱饵蛋白(HSPC238)的重组载体pGBKT7-HSPC238,连接体系再次转化大肠杆菌Top10以扩增重组载体(pGBKT7-HSPC238),随机挑取3个转化子接种于带卡那抗性的液体LB培养基过夜,抽提质粒并电泳初步鉴定质粒,酶切进一步鉴定是否插入了目标片段(HSPC238)。1.2诱饵载体的酵母转化及自激活检测经过鉴定的pGBKT7-HSPC238载体与pGADT7空载体采用醋酸锂法共转化酵母AH109细胞,同时根据试剂盒说明书中的要求设置阳性及阴性对照,分别涂布不同营养缺陷性平板,通过蓝白斑筛选及营养缺陷筛选,判断诱饵蛋白HSPC238对酵母AH109是否存在毒性及自激活活性。2.人胎肝cDNA文库的筛选2.1文库质粒的扩增、抽提和转化筛选稀释文库菌液后涂布LB+Amp平板扩增培养,抽提文库质粒,检测所得文库质粒的浓度及质量。用含有正确pGBKT7-HSPC238载体的感受态酵母菌AH109作为受体菌,将文库质粒转入其中,观察转化结果。2.2阳性克隆的鉴定和质粒抽提用绒布对筛库平板(SD-Trp-Leu-His平板)进行影印清除,以消除背景生长菌落的影响,挑取再次长出的转化子依次经SD-Trp-Leu-His+3AT平板、SD-Trp-Leu-His-Ade平板及蓝白斑筛选,将能同时通过3个报告基因(LacZ,HIS3和ADE2)检测的阳性克隆菌株接种于SD-Leu液体培养基,振荡培养过夜后抽提酵母质粒,转化大肠杆菌Top10进行扩增培养,转化子转接含有Amp的LB液体培养基扩增后抽提质粒。2.3阳性克隆质粒的BLAST比对分析及回转验证对质粒进行DNA测序和BLAST比对,结合生物信息学分析,确定阳性克隆菌落所含目标蛋白的基因名。将抽提到的阳性克隆质粒分别与诱饵基因质粒(pGBKT7-HSPC238)共转化同一个酵母细胞,再次检验每一对蛋白在共转化的酵母细胞中对3个报告基因(LacZ, HIS3和ADE2)的激活情况。对其中重复出现的阳性克隆只选取其中ORF (Open Reading Frame,开放阅读框)序列最长的一个。最后根据文献分析,初步锁定五种可能与HSPC238相互作用的目标蛋白用于后续研究。3. HSPC238与目标蛋白相互作用的鉴定3.1激光共聚焦定位检测构建HSPC238、目标蛋白的过表达质粒,其中HSPC238蛋白携带Flag标签(pcDNA3.1-HSPC238-Flag),目标蛋白携带His标签(pcDNA3.1-目标蛋白-His)。分别将pcDNA3.1-HSPC238-Flag质粒与pcDNA3.1-目标蛋白-His质粒瞬时共转染293T和SMMC7721细胞,依次加入一抗(兔源性anti-HSPC238、鼠源性anti-目标蛋白)、二抗(CY3标记的羊抗兔二抗、FITC标记的羊抗鼠二抗)后孵育,通过激光共聚焦显微镜观察HSPC238及目标蛋白在293T和SMMC7721细胞中的共定位情况,以确定目标蛋白与HSPC238蛋白是否在细胞内存在空间相遇的可能。3.2免疫共沉淀分析HSPC238与目标蛋白是否在体内存在相互作用以HSPC238过表达质粒(pcDN A3.1-HSPC238-Flag)和目标蛋白过表达质粒(pcDNA3.1-目标蛋白-His)分别共转染293T、SMMC7721细胞株,裂解细胞后收集蛋白上清,以anti-Flag抗体进行免疫共沉淀以获取共沉淀物,再分别以anti-His、anti-Flag、anti-HSPC238、anti-目标蛋白做免疫印迹,同时与细胞裂解液比较,以确定HSPC28和目标蛋白是否存在相互作用。3.3 Pull-Down分析HSPC238与目标蛋白是否在体内存在相互作用以HSPC238过表达质粒(pcDNA3.1-HSPC238-Flag)和目标蛋白过表达质粒(pcDNA3.1-目标蛋白-His)分别共转染293T、SMMC7721细胞株,裂解细胞后,收集蛋白上清,镍柱纯化携带His标签的目的蛋白,BCA法测定洗脱液浓度,选取浓度最高的一组点样,以anti-Flag、anti-HSPC238、anti-His、anti-目标蛋白等抗体做免疫印迹,同时与细胞裂解液比较,以确定HSPC238和目标蛋白是否存在相互作用。结果：1.重组诱饵质粒载体的构建、酵母转化及自激活检测扩增后的pUC19-HSPC238质粒与诱饵质粒pGBKT7双酶切后,在T4连接酶的作用下成功连接,连接体系转化大肠杆菌Top10扩增后抽提质粒电泳并测序表明：包括sfiI酶切位点在内的序列均未发生突变,重组质粒pGBKT7-HSPC238构建成功；进一步转化酵母AH109细胞,经通过蓝白斑筛选及营养缺陷筛选,三种报告基因(LacZ, HIS3和ADE2)均未激活,即诱饵蛋白HSPC238对酵母AH109不存在毒副作用及自激活活性。2.人胎肝cDNA文库的筛选文库菌经稀释后扩增并抽提质粒,最终得到的文库质粒浓度为600ng/ul。涂布LB+Amp抗性平板,随机挑取单克隆进行质粒抽提,经琼脂糖凝胶电泳检测,所得文库质粒均插入了不同条带的目的基因,即文库质量合格。将此文库质粒转入含有正确pGBKT7-HSPC238载体的酵母菌AH109,用绒布对筛库平板(SD-Trp-Leu-His)进行影印清除后,继续培养两周,初步得到124个转化子菌落。转接SD-Trp-Leu-His+3AT平板,排除11个由于AH109菌株中his3基因渗漏表达所造成的假阳性菌落。再次转接SD-Trp-Leu-His-Ade平板,排除7个不能激活HIS3和ADE2报告基因的假阳性菌落。最后检测LacZ报告基因,通过蓝白斑筛选,再次排除掉不能变蓝的42个假阳性菌落,最终得到64个可能存在与人HSPC238相互作用蛋白的可疑菌落。将同时通过了3个报告基因(LacZ, HIS3和ADE2)检测的64个可疑阳性克隆菌株转接SD-Leu液体培养基,扩增培养后抽提酵母质粒,转化大肠杆菌Top10进行扩增,转化子转接含有Amp的LB液体培养扩增后抽提质粒,对质粒进行DNA测序和BLAST比对结合生物信息学分析,表明它们分别编码19种不同的蛋白质。且编码该19种蛋白的阳性菌落均通过回转验证,最后经查阅文献,我们选定最有可能与HSPC238相互作用的五种蛋白(HMOX1, MT2A, RPS27A, UBB, RPL5)用于后续研究。3. HSPC238相互作用蛋白的鉴定激光共聚焦技术观察显示,HSPC238蛋白与目标蛋白(HMOX1, MT2A, RPS27A, UBB, RPL5)在293T和SMMC7721细胞中都分布于细胞质中,在胞质中高度共存,即有在胞质中存在相互作用的可能。免疫共沉淀前期实验中,pCDNA3.1-RPL5-His质粒瞬时转染293T细胞,以anti-His尝试多次仍无法检测到RPL5蛋白的表达,故排除RPL5蛋白,后续实验仅以HMOX1, MT2A, RPS27A, UBB作为研究对象。免疫共沉淀实验结果表明,共转染组裂解细胞收集的蛋白上清液,经anti-Flag抗体获取共沉淀物后,经anti-His、anti-Flag、anti-HSPC238、anti-目标蛋白(HMOX1, RPS27A, UBB, MT2A)等抗体做免疫印迹,均能检测到正确大小的目的条带,且与细胞裂解液中的表达位置基本一致,由此,我们推测HSPC238与HMOX1, RPS27A, UBB, MT2A等目标蛋白在293T和SMMC7721细胞株内发生了结合。Pull-Down实验表明,共转染组裂解细胞收集的蛋白上清液,经镍柱纯化携带His标签的蛋白复合物,洗脱后选取洗脱液浓度最高的一组点样,以anti-Flag、 anti-HSPC238、anti-His、anti-目标蛋白(HMOX1, RPS27A, UBB, MT2A)等抗体做免疫印迹,结果显示洗脱液中能检测到预期的目的条带,且与裂解液组的泳带位置基本一致,由此我们推测HSPC238与HMOX1, RPS27A, UBB, MT2A存在相互作用。结论：本实验成功构建了HSPC238真核表达载体,通过酵母双杂交技术从胎肝cDNA文库中筛选到与HSPC238相互作用的目标蛋白,经文献分析初步锁定几种特定蛋白后,通过激光共聚焦、免疫共沉淀及Pull-Down实验证实了HSPC238与目标蛋白在细胞体内存在相互作用。本实验为进一步研究HSPC238的功能及在肝癌中的作用机制奠定了基础。