肺癌是世界上发病率和死亡率最高的癌症种类之一,早发现、早治疗是降低其死亡率的最有效途径。因此,肺癌的早期诊断具有重要的临床意义。在临床上,肺癌的诊断方法主要以组织成像和组织活检为主。然而,这些方法具有很多缺点,比如成像技术造成的辐射副作用和组织穿刺给病人带来的痛苦。从流体样品(例如外周血和尿液)获得的分子信息的液体活组织检查技术为肺癌的诊断提供了新的方法。与传统的组织取样相比,液体活检是一种非侵入性的、安全且易于重复的取样方法,医生能够通过简单的液体样本发现有关疾病或肿瘤的一系列信息。目前,体液中的蛋白质分子已被各个国家食品和药物管理局(FDA)批准为癌症生物标志物。血清蛋白标志物的检测也在肺癌诊断和预后评估中展现出了很重要的地位。然而,目前使用的蛋白标志物是广谱型的,对于肺癌的诊断敏感度和特异度显得乏力。因此,寻找更多的蛋白标志物对肺癌的精确诊断和预后评估具有重要的作用。除此之外,为了提高诊断的准确度和效率,多种蛋白标志物的同时检测技术也亟待被开发。单分子阵列技术(Simoa),是用于免疫分析的数字化形式的酶联免疫吸附实验(ELISA),将与磁珠相连的免疫复合物捕获并单独封闭在Simoa光盘上飞升大小的微孔中,实现对蛋白标志物的高灵敏度检测。其检测的平均灵敏度是传统技术的1000倍,在生命科学、体外诊断、伴随诊断、血液筛查、药物研发等方面有广阔的应用前景。本论文结合单分子阵列(Simoa)技术发展了一系列高灵敏的蛋白质标志物检测新方法,并筛选出几种对肺癌诊断具有潜在应用价值的新蛋白质标志物。主要内容包括以下几个方面:(1)基于Simoa平台检测血清中的促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(Erythropoietin-producinghepatocellularreceptorA2,EphA2)及评估其在肺癌检测中的应用价值。在90%的肺癌组织样本中,蛋白EphA2被证明是过量表达的。EphA2的表达量与肺癌的发生呈正相关,它的过表达预示着较差的存活率。组织活检证明EphA2的过表达对肺癌的检测有一定的诊断和预后评估价值。血清EphA2在肺癌检测中的是否具有同样的价值,需要进一步评估。本章发展了一种基于Simoa技术的超灵敏检测血清EphA2的方法。该方法具有快速、灵敏度高及检测范围宽等优点。该方法对EphA2的检测范围是0.5-1024pg/mL,检测限为0.102pg/mL。同时,本方法对EphA2检测具有很高的选择性。血清验证实验和加标回收实验也证明该方法可用于人血清中EphA2的高灵敏检测。接着,我们采用所发展的方法测试了26例健康样本、20例良性肺病样本和39例肺癌样本中血清EphA2蛋白的浓度。结果显示血清EphA2的高表达与肺癌有关,可能是肺癌发展的早期效应生物标志物。(2)基于Simoa平台检测碱性成纤维细胞生长因子(Basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)及评估其在肺癌检测中的应用价值。蛋白bFGF在人血清中具有非常低的浓度,处于亚皮克水平,需要高灵敏的检测技术对其诊断价值进行准确评估。本章基于Simoa技术发展了bFGF超灵敏检测的方法,该方法对bFGF具有较宽的检测范围(0.125-128pg/mL)和较低的检测下限(0.046pg/mL)。另外,选择性实验结果证明了该方法对bFGF检测具有较高的专一性。血清验证实验和加标回收实验也证明该技术可用于人血清中bFGF的检测。此外,本章基于所发展的bFGFSimoa实验对临床肺癌血清样本中的bFGF进行了初步评估,并得到了良好的检测效果。在区分健康组和肺癌组时,bFGF的敏感度达到90%,特异度达到92.6%,ROC曲线下面积(AUC)为0.929。因此,本章发展的bFGFSimoa实验对于肺癌的早期诊断及相关研究展现了巨大的潜力。(3)基于Simoa技术超灵敏检测胃泌素释放肽前体(ProGRP)。ProGRP作为高特异性的小细胞肺癌标志物,具有较低的血清浓度和较差的稳定性。本章基于单分子阵列技术发展了对应的ProGRPSimoa超灵敏检测方法。较之前报道的方法,该方法具有快速、灵敏度高及检测范围广等优势。该方法的线性检测范围为0.03125-512pg/mL,灵敏度低至0.024pg/mL。血清样本实验和加标回收实验证明所发展的方法在复杂样本中也具有很好的检测效果。本实验在所选临床样本中未取得理想的检测效果,可能与ProGRP在血清中稳定性差有关。因此,我们推测该方法对于研究ProGRP在血清中的降解和相关酶动力学具有潜在的应用价值。(4)本章首次利用Simoa技术发展了一种对人自身免疫抗体星形胶质细胞上调基因1(AEG-1)高灵敏检测的方法。该方法在一定程度上拓展了该技术在生物标志物检测领域的应用范围。发展的人AEG-1自身免疫抗体Simoa方法具有自动化、快速、灵敏度高、检测范围宽等优点,对相关领域的研究和自身免疫抗体的发现提供了技术支撑。此外,本论文发展的人AEG-1自身免疫抗体Simoa实验对于肺癌和其它疾病的早期诊断及相关研究展现了潜在的应用前景。(5)基于双重Simoa实验同时评估叶酸受体α(FOLR1)和成纤维细胞生长因子21(FGF21)在肺癌诊断中的应用价值。FOLR1在癌细胞表面过量表达,常用作肺癌靶向治疗的靶点蛋白。血清FOLR1对于肺癌的诊断和预后评估还很少被研究。据报道,FGF21具有一定的抗癌作用,其血清水平是否随着肺癌的发展而发生变化也没有被报道。本章利用Simoa技术发展了同时检测血清FOLR1和FGF21的双重实验并评估了二者在肺癌中的检测价值。发展的双重Simoa实验具有自动化程度高、灵敏度高、样本量需求少等优点。FOLR1和FGF21检测限分别达到3.8pg/mL和1.6pg/mL。血清验证实验和加标回收实验也证明该方法可用于人血清中FOLR1和FGF21的同时检测。此外,基于所发展的双重Simoa方法,我们对临床肺癌血清样本中FOLR1和FGF21的浓度进行了初步评估。通过对比健康人、良性肺病和肺癌患者血清中的FOLR1和FGF21浓度,发现血清FOLR1的浓度在三者之间表现出明显差异,而FGF21未表现出明显区别。因此,本实验证明了血清FOLR1在肺癌诊断中具有一定的诊断价值。(6)基于Simoa技术发展一种四种肺癌标志物同时检测实验。本章针对四种经典肺癌标志物(癌胚抗原CEA、癌抗原CA125、细胞角蛋白19片段Cyfra21-1、人附睾蛋白HE4)发展了对应的四重Simoa同时检测实验。该实验具有高效、快捷、灵敏度高、样本量少等优点。血清验证实验表明该四重Simoa实验可用于人血清中CEA、CA125、Cyfra21-1和HE4的同时检测。此外,基于所发展的四重Simoa实验对临床肺癌血清样本中四种蛋白标志物的浓度进行了初步评估。结果显示,该四重Simoa实验不仅满足临床检测需求,也证明了标志物组合检测具有更高的敏感度和准确度。(7)基于原位合成的蓝绿色荧光硅纳米点检测葡萄糖。葡萄糖不仅是人体重要的能量来源,而且还作为很多疾病的生物标志物。本章提出了一种通过一步合成水溶性荧光硅纳米点(SND)直接监测葡萄糖水平的新方法。SND是通过葡萄糖和氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)之间的氧化还原反应合成。SND在水中表现出良好的分散性、高蓝色荧光、较强的光稳定性和宽的pH耐受性,激发/发射峰波长为410/475nm。通过研究SND的发射特性发现,该方法基于监测原位合成SND的可见光发射能够在很宽的检测范围内检测低浓度的葡萄糖。