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目的:蛋白质的泛素化修饰是细胞内的一种基本调控机制,参与调控细胞循环,DNA修复,信号转导和转录活化等多种细胞进程。这种转录后修饰是一种动态的、可逆的过程,由多种泛素结合酶和去泛素化酶调节控制。其中去泛素化酶可以特异性的去除泛素化蛋白底物上的泛素分子,从而调控细胞进程。去泛素化酶家族大约有95个成员,按结构和功能分为五种类型,包括泛素羧基末端水解酶(UCHs),泛素特异性蛋白酶(USPs),含Machado-Joseph结构域的蛋白酶(MJDs),卵巢肿瘤蛋白酶(OTUs)和JAMM Motif蛋白酶。USPs是去泛素化酶家族中种类最多,结构最为复杂的一类,人类有54种USPs,它们的氨基酸序列都含有高度保守的结构域:Cys,His和Asp/Asn结构域。本课题所研究的泛素特异性蛋白酶13(USP13)属于USPs家族,但对于USP13的功能活性和组织分布等都还没有详尽的研究报道。本研究通过对大鼠脑组织和人类TE-1食管癌细胞株usp13基因的克隆,了解usp13在大鼠不同组织中的分布情况,建立去泛素化酶活性检测体系,寻求检测USP13去泛素化酶活性的最佳方法,为进一步研究USP13的活性和生物学功能奠定基础。方法:(1)运用分子克隆的方法克隆usp13基因。采用TRNzol裂解法提取大鼠脑组织总RNA,采用分段扩增的方法,运用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分别扩增获得usp13-5′和usp13-3′。将usp13基因5′和3′分别克隆至pGEM-T easy载体,通过蓝白斑筛选实验确定阳性克隆并应用碱裂解法提取质粒,进行双酶切鉴定及测序分析。(2)采用荧光定量PCR(Real-Time RT-PCR)2-ΔΔCt相对定量方法检测usp13在大鼠脑组织、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、骨骼肌、脾脏和睾丸中的相对表达水平。以GAPDH基因作为内参,将标本间RNA的质量和逆转录效率的差异进行标准化。以usp13在脑组织中的表达水平作为校准样本,比较各组织中usp13表达水平的差异。(3)GST-USP13融合蛋白的表达首先将usp13-5′基因克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,得到pGEX-usp13-5′质粒,然后将usp13-3′基因克隆到pGEX-usp13-5′质粒中,最终得到pGEX-usp13质粒。在大肠杆菌DH5α中表达,获得120 kDa左右的GST-USP13融合蛋白,同时检测融合蛋白GST-USP13的可溶性。(4)构建两种去泛素化酶活性检测体系,检测大鼠USP13去泛素化酶活性。①T7-USP13/GST-Ub52方法采用定向克隆的方法构建pAC-T7-usp13质粒,可表达带有T7标签的T7-USP13蛋白。pAC-T7-usp13表达质粒与标准底物(GST-Ub52)表达质粒pGEX-Ub52共转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导后共表达,研究去泛素化酶的活性。以GST-Ub52做为标准底物,分子量为45 kDa,去泛素化后分子量为36 kDa。以去泛素化酶USP46作为阳性对照。用GSH-Sepharose-TM Resin纯化蛋白系统纯化GST融合蛋白,进行10% SDS-PAGE电泳检测。②GST-USP/Ub-Met-β-gal方法以GST-USP13融合蛋白的表达质粒pGEX-usp13和表达Ub-Met-β-gal融合蛋白底物的pAC-M-β-gal质粒共转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导后共表达,用anti-β-gal抗体进行蛋白印记分析。以USP46作为阳性对照,用Odyssey红外荧光扫描成像系统进行分析。(5)运用分子克隆的方法从人类TE-1食管癌细胞株中克隆usp13基因,采用去泛素化酶活性检测系统检测人类USP13去泛素化酶活性。结果:(1)本课题从大鼠脑组织中成功克隆出泛素特异性蛋白酶usp13基因。大鼠usp13基因的编码区由2,577个碱基组成,编码858个氨基酸,推测其相对分子质量约为96 kDa。USP13包含高度保守的结构域:Cys,His和Asp区域,符合泛素特异性蛋白酶的特征。(2)usp13在大鼠脑组织、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、骨骼肌、脾脏和睾丸中均有表达,其中肺脏和肾脏中的表达量略高于脑组织中的表达量,分别是脑组织中表达量的1.17和1.13倍;心脏、肝脏和脾脏中表达水平与脑组织相近,分别是其1.04、1.02和0.91倍;而在睾丸和骨骼肌中表达较少,仅为脑组织中的0.55、0.36倍。(3)表达出GST-USP13融合蛋白。含重组质粒pGEX-usp13的大肠杆菌DH5α经IPTG诱导,出现一种分子量约为120 kDa的新蛋白表达,与GST(分子量为26 kDa)和USP13(分子量约为96 kDa)的理论分子量相符,并且37℃诱导4小时该融合蛋白为不溶性蛋白,在15℃经TPTG诱导40小时,GST-USP13融合蛋白部分可以溶解。(4)建立两种去泛素化酶活性检测体系,可以成功检测到作为阳性对照的USP46的去泛素化酶活性,也可以检测到USP13和特异性底物的表达,但对于检测USP13的去泛素化酶活性,两种体系均不理想。(5)从人类TE-1食管癌细胞株中克隆出usp13基因,人类usp13的编码区由2,592个碱基组成,编码863个氨基酸,推测其相对分子质量约为97 kDa。并且两种去泛素化酶活性检测体系对于检测人类USP13的去泛素化酶活性同样未得到理想结果。结论:(1)克隆出大鼠泛素特异性蛋白酶usp13基因(GenBank accession number: GU459226)(2)usp13在大鼠各组织中均有表达,其中以肺脏和肾脏为最高。(3)成功表达出GST-USP13可溶性蛋白。(4)建立了两种去泛素化酶活性检测体系,但两种方法未能检测USP13的去泛素化酶活性。(5)从人类TE-1食管癌细胞株中克隆出usp13基因(GenBank accession number: HM138083)