水蛭为蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全体,具有破血通经,逐瘀消癥的功效。目前在我国中药材市场上,水蛭药材的主要来源为蚂蟥,即宽体金线蛭。国内关于蚂蟥中抗凝血活性成分的研究报道较少,其功效物质基础和作用机制尚未明确;尤其是该动物药为非吸血水蛭品种,且以水煎剂应用时仍具有功效,因而其中可能存在热稳定抗凝血活性蛋白。目的:以蚂蟥为研究对象,采用生物活性导向分离模式,对其抗凝血活性成分进行提取、分离与纯化,并对所得到的热稳定单体蛋白进行体内与体外抗凝血药效验证以及结构鉴定。方法:采用超声法、匀浆法、煎煮法和脱脂预处理-煎煮法等方法对蚂蟥进行提取,并比较不同提取物的抗凝血活性,以确定蚂蟥提取物最佳提取工艺;依次使用DEAE-52纤维素阴离子交换树脂、G-75凝胶过滤层析材料和CN高效液相色谱柱对蚂蟥提取物进行分离以得到一个具有较强抗凝血活性的蛋白,并对该蛋白的温度稳定性、p H稳定性和酶解稳定性进行表征;利用LC-MS/MS等技术分析此单体蛋白结构,并通过Peaks Studio与Uniprot中水蛭数据库进行比对;采用体外血浆凝固、纤维蛋白凝固、纤维蛋白原降解及细胞实验对此蛋白体外抗凝活性进行评价;测定此蛋白对正常小鼠和健康人血浆凝血四项指标的影响,构建卡拉胶诱导的小鼠慢性血栓模型并给予治疗,对此蛋白体内抗凝血活性进行评价。结果:料液比为1:30时,使用生理盐水以超声法提取120 min,所得的蚂蟥提取物的抗凝血活性最强,血浆复钙时间为277.50 s,得率和蛋白质含量分别为43.62%和62.65%,SDS-PAGE分析显示提取物中蛋白条带较为丰富。从蚂蟥中分离纯化得到一个具有较强抗凝血活性的蛋白WP-77,分子量约为20.8 kD,该蛋白在20℃～100℃、p H 2～p H 10范围内保持稳定,并且能够对抗胃蛋白酶的消化而保持抗凝血活性。WP-77经鉴定及数据库匹配得到6个蛋白质,其中与Q2LDZ7、Q2LDZ6、Q2LDZ8三个蛋白的匹配度较高,其具体蛋白结构仍有待进一步解析。WP-77显著延长兔血浆凝固时间（P＜0.01）,减缓凝固速度;可水解纤维蛋白原的α-支链和β-支链,且当浓度为5 mg/m L时可完全水解α-支链;此外,不同浓度WP-77均能较好地抑制纤维蛋白凝块的形成,抑制率在50%以上。WP-77可抑制凝血酶对EA.hy926细胞的损伤,在浓度为50μg/m L、孵育时间为6 h时抑制率最强。高剂量（10 mg/kg和20 mg/kg）WP-77可显著增加小鼠血浆活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）值并降低纤维蛋白原（Fib）值（P＜0.01）,而对凝血酶原时间（PT）值无明显影响;同时,WP-77能显著增加人血浆APTT和TT值（P＜0.01）,而对PT和Fib值则无明显影响。WP-77能降低模型小鼠黑尾率,显著增加APTT并降低Fib值（P＜0.01）,当剂量为10mg/kg时更为安全,而对PT值和TT值则无明显影响。结论:本论文从非吸血水蛭品种蚂蟥的提取物中分离与纯化得到了一个新颖的热稳定抗凝血活性蛋白质WP-77,并通过体内外实验验证其药效以及采用生物质谱对其进行结构分析,有助于阐明蚂蟥破血通经、逐淤消癥的物质基础以及作用机理,并为进一步开展其抗凝血活性蛋白质的结构改造以及构效关系研究奠定基础。