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纤维化是各种器官慢性损伤的共同结果,可引起细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解/合成失衡,结缔组织增多,实质细胞减少,最终导致器官结构、功能破坏乃至器官衰竭,严重影响人类健康。随着科学的发展,对纤维化的病因、发病机制、基本生物学的认识以及纤维化疾病的诊断和治疗都取得了长足的进步,但迄今尚未找到有效的治疗方法,纤维化的危害仍未消除,纤维化的防治研究仍是人们关注的热点。我们前期研究中选用含4096个人类基因的表达谱芯片对增生性瘢痕患者和同体正常皮肤进行差异表达基因的筛选,发现其中一个基因P311在烧伤病人早期增生性瘢痕组织中表达显著增高[1-2]。P311蛋白不属于任何一种已知蛋白家族,研究发现P311可以诱导TGF-β1非依赖的肌成纤维细胞表型样改变,提示可能参与纤维化的发生发展[3-4]。为进一步探讨P311基因在纤维化中的潜在分子机制,我们利用酵母双杂交系统,筛选了成人肝cDNA文库,获得了与P311相互作用的候选蛋白整合素β4结合蛋白(Integrin beta 4 binding protein,ITGB4BP) [5]。ITGB4BP,又名真核启动因子6(eIF6)、p27BBP,能与整合素β4胞浆区发生相互作用[6]。研究发现:ITGB4BP参与核糖体60S亚基的合成[7-9],参与RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)的形成而调控某些mRNA的降解[10]。在肿瘤组织如乳腺癌中和激活的肥大细胞中高表达[11-13]。TGF-β1是一生物学功能十分广泛的细胞因子,能与细胞表面TGF-β受体结合,通过Smads和非Smads信号通路,对炎症反应、细胞增殖、分化、凋亡及细胞外基质的合成等起重要的调节作用[14-17]。目前认为,TGF-β1是介导器官纤维化的最关键的细胞因子[18-23]。Wnt信号通路参与调控细胞形态与功能分化、细胞癌变、凋亡、免疫与应激等,在胚胎发育、肿瘤发生和器官纤维化等重要生理及病理过程中发挥重要作用[24,25].。Wnt信号途径通过与TGF-β信号通路“串话”而共同参与器官纤维化的发病[26,27].。目前,抑制TGF-β1及其信号通路取得了不小的进展,有些药物和试剂也已开始应用于临床[28-30]。但是,由于TGF-β1分子广泛的生物学作用,不可避免地带来一定的负作用,如发育缺陷、免疫抑制、肿瘤发生等[31].。因此,探讨调控纤维化相关基因TGF-β1及其信号通路在纤维化疾病形成、发生及发展中的具体机制,对于更有效、安全地以TGF-β1为靶目标治疗器官纤维化意义重大。我们前期实验发现,利用腺病毒技术,在增生性瘢痕来源成纤维样细胞中高表达ITGB4BP蛋白后,能抑制α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原纤维(CollagenⅠ)的表达,成纤维细胞的激活和转分化受到抑制[32]。结合国内外研究进展以及本课题组前期研究,我们提出以下假设:ITGB4BP是否作用于TGF-β1分子,进而影响TGF-β1信号通路调控纤维化的发生发展。基于以上假设,本课题分三部分进行:①在增生性瘢来源成纤维细胞和人胚肾上皮细胞(HEK293)中高表达ITGB4BP后,检测TGF-β1基因和蛋白表达改变;②构建TGF-β1启动子区报告基因载体,观察ITGB4BP对TGF-β1启动子活动的影响;通过体外凝胶电泳迁移实验(EMSA)和质谱技术(MS)鉴定ITGB4BP与TGF-β1启动子区的结合作用;③ITGB4BP对Wnt信号通路活性的影响。一、高表达ITGB4BP基因对TGF-β1基因和蛋白表达水平的影响利用融合ITGB4BP蛋白的重组载体,感染增生性瘢痕来源成纤维细胞和人HEK293细胞,提取细胞总RNA和蛋白,定量PCR和Westernblot检测TGF-β1基因和蛋白表达。我们发现成纤维细胞和HEK293细胞高表达ITGB4BP基因后,能显著抑制TGF-β1基因和蛋白表达。与阴性对照组相比,基因表达降低约60%,两组比较有显著差异(p=0.008);蛋白表达降低约70%,两组比较有显著差异(P=0.017)。二、ITGB4BP调控TGF-β1启动子实验研究根据TGF-β1启动子区序列,构建不同TGF-β1启动子截短体至报告基因载体pGL3-basic,分别与ITGB4BP共转染HEK293细胞,观察ITGB4BP对不同TGF-β1启动子截短体活性的影响。结果发现,与空载体对照组相比,ITGB4BP能稳定抑制TGF-β1第二启动子(+11~+271)活性。合成不同TGF-β1第二启动子片段,放射性同位素标记后,与HEK293细胞核蛋白共孵育后,凝胶电泳迁移实验(EMSA)观察TGF-β1启动子与蛋白的相互作用。结果显示ITGB4BP蛋白能与TGF-β1启动子(+204~+271)区域相互作用。切取EMSA凝胶电泳滞后条带,胶内酶解后质谱鉴定,利用蛋白质数据库查找相互作用蛋白。质谱结果提示超迁移带中含有ITGB4BP蛋白。三、高表达ITGB4BP蛋白对Wnt信号通路活性的影响在HEK293细胞高ITGB4BP蛋白后,用TOPflash报告基因载体检测T细胞因子/淋巴细胞增强因子(TCF/LEF)转录活性。提取HEK293细胞蛋白,Westernblot检测β-catenin表达量。同时免疫细胞化学观察β-catenin胞浆胞核分布。结果发现,高表达ITGB4BP后能抑制Wnt通路调控的TCF/LEF转录活性;Westernblot发现ITGB4BP能抑制β-catenin蛋白表达。免疫细胞荧光发现高表达ITGB4BP后β-catenin胞浆和胞核分布减少。结论纤维化是一组由多种病因引起的破坏性疾病,其发病机制尚未阐明。我们的研究发现成纤维细胞和HEK293细胞高表达ITGB4BP基因后,能抑制细胞中TGF-β1的表达。这种抑制作用可能是ITGB4BP通过抑制TGF-β1第二启动子转录活性起作用的。ITGB4BP还能通过抑制β-catenin蛋白的表达而抑制Wnt信号通路活性。通过我们的研究,可能从更深层次上为纤维化的发病机制研究和治疗干预提供新途径。