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目的:探讨磷酸二酯酶9(PDE9)-环磷酸鸟苷(cGMP)-cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)信号通路在脑缺血后海马神经发生中的作用,并观察天麻素(GAS)的作用及其可能机制。方法:用7~8周龄雄性C57BL/6小鼠,采用双侧颈总动脉夹闭(BCCAO)方法建立小鼠脑缺血模型,而后给予不同剂量GAS(50 mg/kg/d和100mg/kg/d,i.p.)治疗14 d。于造模后d 8用H.E.染色观察海马CA1区锥体神经元病理形态;d 15利用BrdU和DCX免疫荧光染色观察海马齿状回神经干细胞(NSCs)的增殖和迁移,d 29 BrdU/NeuN双标免疫荧光染色检测海马齿状回NSCs分化整合,用ELISA分析PDE9活性和cGMP水平,并用Western blot检测PKG和脑源性神经营养因子(BDNF)的蛋白表达;d 29开始至d 34结束,利用Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力。为进一步确定信号通路的作用,采用悬浮培养法分离纯化新生1日龄SD大鼠的海马NSCs,利用氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)法模拟建立脑缺血模型,观察GAS(0.01μmol/L,0.1μmol/L及1μmol/L)的改善作用。并分别给予PDE9抑制剂PF-04447943和PKG抑制剂KT5823,观察PDE9-cGMP-PKG相关信号通路的变化情况。NSCs的存活和增殖分别利用CCK-8法和BrdU免疫荧光染色进行评估。结果:1.PDE9-cGMP-PKG信号通路在脑缺血后海马神经发生中的作用1)BCCAO术后d 8,模型组小鼠海马CA1区锥体神经元结构不规则,出现明显核固缩,排列松散,神经元细胞数目明显减少(P<0.01);d 29 Morris水迷宫实验中,模型组小鼠空间学习和记忆能力均明显下降(P<0.05)。这些结果提示,小鼠出现了脑缺血损伤。同时,模型组小鼠海马齿状回BrdU、DCX和BrdU/NeuN阳性细胞数量明显增加(P<0.01);PDE9活性降低(P<0.01),cGMP水平和PKG、BDNF蛋白表达均升高(P<0.05)。2)OGD/R后,模型组NSCs细胞活力降低(P<0.01)。同时,模型组BrdU阳性细胞数增加(P<0.05),PDE9活性降低(P<0.05),cGMP水平升高(P<0.05),PKG和BDNF的蛋白表达升高(P<0.05)。给予PF-04447943后细胞活力明显改善(P<0.01);在模型组基础上,PDE9活性进一步降低(P<0.01),cGMP-PKG显著升高(P<0.05),BDNF蛋白表达明显上调(P<0.01)。此外,除PDE9活性和cGMP水平外,KT5823可明显阻断PF-04447943的上述作用(P<0.05)。2.GAS促脑缺血后海马神经发生的作用及其与PDE9-cGMP-PKG信号通路的关系1)小鼠脑缺血模型建立后,给予不同剂量GAS(50 mg/kg/d和100mg/kg/d,i.p.)治疗14 d,小鼠海马CA1区的锥体神经元形态结构改善,正常神经元数量增加(P<0.01)。同时,脑缺血损伤小鼠空间学习和记忆能力明显提高(P<0.05)。在模型组基础上,海马齿状回BrdU、DCX和BrdU/NeuN阳性细胞数量明显增加(P<0.05);PDE9活性进一步降低(P<0.01),cGMP-PKG和BDNF表达均明显升高(P<0.05)。2)在OGD/R损伤的海马NSCs,GAS(0.01μmol/L,0.1μmol/L及1μmol/L)剂量依赖地改善NSCs的细胞活力降低,促进其增殖(P<0.05)。在OGD/R模型组基础上,GAS进一步降低了PDE9活性(P<0.05),上调cGMP-PKG和BDNF的表达(P<0.05)。KT5823取消GAS改善OGD/R损伤细胞活力的作用(P<0.05),并阻断GAS刺激的PKG和BDNF表达的增加(P<0.05),但对其在PDE9活性和cGMP水平的作用没有影响。结论:1)PDE9-cGMP-PKG信号通路参与了脑缺血后海马神经发生的过程。2)GAS促进脑缺血后海马神经发生,其作用可能与PDE9-cGMP-PKG相关通路有关。