研究背景中国癌症中心最新发表的国内恶性肿瘤流行病学数据显示,胃癌(gastric cancer,GC)的发病率和死亡率均居于各类型恶性肿瘤前三位。胃癌早期检出率低,约80%病例确诊时已是晚期,而奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)作为晚期胃癌病人的一线治疗用药,其耐药现象却越发明显,导致部分晚期胃癌病人化疗的有效率低,预后差。胃癌对奥沙利铂耐药产生的机制十分复杂,包括肿瘤细胞自身异质性、基因突变及表观遗传改变等,具体机制包括通过增加奥沙利铂外排、上调耐药基因或蛋白表达、增强肿瘤细胞的自噬能力、加强DNA修复等。全面深入研究和阐明胃癌对奥沙利铂耐药的机制,将对改善胃癌患者的预后有极大的获益。Atonal bHLH 转录因子 8(atonal bhlh transcription factor 8,ATOH8)是碱性螺旋-环-螺旋蛋白(basic helic-loop-helix,-bHLH)转录因子家族的成员之一,由321个具有bHLH结构域的特征性氨基酸组成,可参与至胚胎和多种组织发育,对细胞分化甚至决定细胞命运方面具有重要意义。近年来,关于ATOH8促进肿瘤化疗耐药的研究日渐增多,如:(1)ATOH8在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)高表达,并降低癌细胞对5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)的化疗敏感性;(2)高表达的ATOH8通过激活糖酵解以促使循环结肠癌细胞产生奥沙利铂化疗抵抗。目前极少研究报道ATOH8与胃癌化疗耐药之间的关系,但我们前期实验发现ATOH8在胃癌中是高表达的。因此,我们在本研究中探讨,ATOH8是否能够通过某些信号通路,以降低胃癌细胞对奥沙利铂的药物敏感性。内质网(endoplasmic reticulum,ER)是细胞内一种精细的细胞器。正常生理状态下,内质网腔内蛋白折叠能力与负载量存在平衡。内源性或外源性因素比如酸碱度失衡、氧化应激(oxidative stress,OS)、化学药物等可干扰内质网稳态及功能而导致未折叠蛋白或错误蛋白在内质网腔积累,并引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)状态。发生应激的细胞可出现适应、抵抗甚至凋亡三种不同结局,而最初为应对内质网应激,细胞会建立一种适应性信号通路,称为非折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。UPR通过减少内质网腔内蛋白负荷并重新建立内质网平衡及功能,以维持细胞存活。越来越多研究表明,UPR导致多种恶性肿瘤如结直肠癌、乳腺癌(breast carcinoma)、胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PD AC)等化疗耐药发生,对肿瘤细胞而言是一种保护机制。Kim等学者在5-FU耐药的结直肠癌细胞株中检测到UPR的激活,而通过靶向UPR关键分子葡萄糖调节蛋白78(the 78 kDa glucose regulated protein,GRP78)可恢复癌细胞对 5-FU 敏感性。目前认为,奥沙利铂主要通过干扰DNA复制及转录杀伤肿瘤细胞。其产生的DNA损伤以及细胞毒性会触发胞内酸碱度失衡、氧化应激、蛋白翻译合成障碍等异常生理过程,而这些进程可能引起细胞内质网应激并导致UPR激活。本研究就ATOH8、UPR与胃癌奥沙利铂药物敏感性关系进行探索,以助于在胃癌抵抗化疗中找到新策略。研究内容1.ATOH8对胃癌细胞奥沙利铂敏感性的作用首先,利用癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA),分析ATOH8表达水平与胃癌患者预后关系,并通过基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)ATOH8表达水平对胃癌的细胞周期、凋亡等过程的影响;接着,从蛋白水平检测在奥沙利铂处理下MKN45、AGS胃癌细胞株ATOH8表达水平改变;最后利用细胞瞬时转染(transient transfection)技术干扰ATOH8表达,并通过MTT检测ATOH8表达水平对胃癌细胞奥沙利铂敏感性的影响。2.ATOH8降低胃癌细胞对奥沙利铂敏感性的机制利用基因表达汇编(gene expression omnibus,GEO)数据库的沉默ATOH8细胞株芯片(GSE435379)进行GSEA聚类分析,发现ATOH8参与至UPR;紧接着从蛋白水平检测在奥沙利铂处理下胃癌细胞内质网应激通路UPR相关指标激活情况以及干性分子表达水平改变;GRP78为UPR关键效应分子,MTT检测加入GRP78抑制剂HA15后胃癌细胞对奥沙利铂的敏感性改变情况。在验证UPR降低胃癌细胞的奥沙利铂药物敏感性基础上,我们探究了 ATOH8与UPR之间的关系。首先干扰ATOH8表达,并从蛋白水平检测UPR相关指标;然后进行转录因子结合位点预测ATOH8与GRP78之间的转录调控关系并通过染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,CHIP)、蛋白免疫印迹(western blotting)、q-PCR加以验证;最后设计回复实验,利用流式细胞术(flow cytometer,FCM)检测细胞凋亡,从而探究在奥沙利铂环境中,加入GRP78抑制剂后是否能逆转ATOH8过表达的胃癌细胞对奥沙利铂药物敏感性。3.IL-6在ATOH8降低胃癌细胞对奥沙利铂敏感性的作用首先分别用加入了白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、白细胞介素8(interleukin 8,IL-8)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、肿瘤生长因子β(transformation growth factor-β,TGF-β)的细胞培养液刺激胃癌细胞24h,并从蛋白水平检测ATOH8表达改变;发现ATOH8在含有IL-6培养液中表达上调,同时通过数据库分析IL-6R、IL-6ST、STAT3与ATOH8表达的相关关系。随后western blotting验证IL-6/STAT3与ATOH8之间的调控关系。最后设计回复实验,通过流式实验、MTT实验检测加入STAT3磷酸化抑制剂stattic后,过表达ATOH8组胃癌细胞的凋亡以及药物敏感性改变情况。研究结果1.ATOH8表达上调可降低胃癌细胞对奥沙利铂敏感性根据生存分析以及GSEA聚类分析发现,ATOH8高表达时抑制肿瘤细胞凋亡通路,且胃癌患者预后更差;Western blotting检测发现经奥沙利铂处理后,胃癌细胞ATOH8蛋白表达水平上升,并且当干扰ATOH8表达时奥沙利铂敏感性发生改变,ATOH8高表达时胃癌细胞对奥沙利铂敏感性降低。2.ATOH8通过促进UPR降低胃癌细胞对奥沙利铂敏感性GSEA聚类分析结果提示ATOH8参与至UPR中。Western blotting检测发现在奥沙利铂处理下,胃癌细胞中UPR相关指标GRP78/IRE1/XBP1表达上升,而加入GRP78抑制剂HA15后,相比于对照组,胃癌细胞对奥沙利铂的敏感性增加。随后我们证实了 ATOH8促进了 UPR效应:(1)过表达ATOH8时UPR相关指标GRP78蛋白表达上调,促凋亡指标BAX下降,抑制凋亡指标BCL2上升。而沉默ATOH8时,则得到相反趋势;(2)转录因子结合位点分析发现在GRP78启动子区TSS上游2000bp区间共有5个E-box序列,提示转录因子ATOH8很可能从转录水平调控GRP78表达。3.IL-6通过上调ATOH8降低胃癌细胞对奥沙利铂敏感性在分别含有IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β的培养基中,检测发现ATOH8水平随着IL-6浓度升高而升高,而与IL-8、TNF-α、TGF-β无明显关系。同时数据库也发现ATOH8表达与IL-6R、IL-6ST、STAT3之间存在正相关关系(P<0.0001)。随后western blotting证实IL-6/STAT3信号通路上调了 ATOH8表达。研究结论IL-6通过促进STAT3磷酸化,上调ATOH8表达。上调的ATOH8通过促进UPR相关分子GRP78表达,以增强UPR效应,从而导致胃癌细胞对奥沙利铂敏感性下降。