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氨基酰-tRNA合成酶催化tRNA的氨基酰化反应，为生物体内蛋白质合成提供原料。为了保证蛋白质生物合成的精确性，氨基酰-tRNA合成酶一方面在氨基酰化反应中通过tRNA的个性元件来准确识别其对应的tRNA使其氨基酰化，另一方面通过编校反应区分对应的氨基酸和其它结构相似的氨基酸。亮氨酸tRNA(tRNALeu)的识别元件比其它氨基酸tRNA更为多变。
本文系统地研究了一种来自古老的超嗜热菌Aquifex aeolicus的亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)对其对应tRNALeu的识别方式。我们突变了tRNALeu各区域中一系列可能参与LeuRS相互作用的核苷酸，得到了这些tRNALeu变种的体外转录产物。通过酶学催化动力学测定，鉴定出辨别子A73、D环参与三级结构的碱基对(U8:A14，G18:U55和G19:C56)、T环的大小和可变茎环的伸展方向均为tRNALeu氨基酰化的重要元件。通过灵敏的酵母三杂交系统发现D环的大小和特定序列以及可变茎的长度对tRNALeu的体内识别具有重要作用。体外和体内实验结果表明反密码子茎环对氨基酰化反应是不必要的，但它携带了用于稳定转移后编校和转位过程的独立的编校元件。我们还通过AatRNAVal UAC和AatRN Ser GCU的体外个性扭转实验，进一步发现AatRNALeu的保守的D环、T环和可变茎环间的协同配合有利于提高氨基酰化和编校反应的效率。亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)通过其独立的编校结构域行使编校功能，区分亮氨酸和其它相似氨基酸来维持遗传密码的精确表达。我们成功构建了酵母胞质leuS基因敲除的酵母体内系统，基于该敲除菌株建立起一套体内方法，可通过确定编校缺陷对酵母细胞生长的直接效应研究真核胞质LeuRS的编校功能。我们通过不同物种来源的LeuRS编校结构域的序列比对，选择酵母胞质LeuRS (ycLeuRS)中保守性不同的若干氨基酸残基，构建这些残基的点突变，得到突变体，测定其体外酶学性质，并拯救酵母敲除菌株。我们使用正缬氨酸检测编校缺陷的拯救菌株的编校活力和它们对一种能锁定LeuRS编校活性位点的特异性抑制剂AN2690的反应。体内系统和体外测定得到的数据相互吻合，而且前者对编校能力的轻微变化更为灵敏。研究结果发现ycLeuRS的转移后编校是体内校正的主要途径，其缺陷会导致非同源氨基酸过量存在时细胞生长受到抑制。ycLeuRS中独有的若干半保守残基(T347、K404、T410、S416和D418)对于体内编校活力的最大化至关重要。此体内系统还可用于检测可能靶定真菌LeuRS的氨基酰化或编校活性位点的候选化合物对酵母细胞的效应。我们通过使用该敲除菌株发现编校缺陷型突变体对AN2690显示出不同的反应。此外，我们还发现ycLeuRS的C末端肽段直接参与同tRNALeu的结合，对酶的编校反应是必需的。而且我们利用该体内系统首次证明人胞质LeuRS(hcLeuRS)具有转移后编校活力并对AN2690敏感。