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酒精性肝损伤(Alcoholic Liver Injury,ALI)是由于长期或过量的酒精摄入导致的肝细胞功能障碍性疾病,是我国常见的肝脏疾病。目前对于ALI的病因普遍接受的观点是,酒精及其在体内的代谢产物使肠道通透性增加,使内毒素/脂多糖(LPS)释放,刺激肝脏巨噬细胞活化,产生大量的促炎细胞因子,从而造成了肝细胞的损伤。我们课题组的前期研究表明,在酒精性肝损伤中肝细胞凋亡广泛发生,抑制肝细胞凋亡是防治肝损伤的重要措施。除戒酒以及保肝药辅助治疗以外,酒精性肝损伤目前尚无有效的治疗方案。因此,进一步研究其发病机制,寻找有效的治疗靶点是亟待解决的科研问题。白细胞介素9(Interleukin-9,IL-9)主要是由Th9细胞产生,尽管IL-9被认为是经典的Th2相关的细胞因子,研究表明IL-9与炎症反应和自身免疫性疾病密切相关,在过去几年受到广泛关注。然而,IL-9在酒精性肝损伤中的作用研究尚无文献报道。本课题通过尾静脉注射腺相关病毒(AAV9)在体过表达IL-9,旨在探究IL-9对酒精性肝损伤巨噬细胞相关的炎症反应以及肝细胞凋亡的影响。在体外实验中我们利用RAW264.7和AML-12细胞株进行实验,观察IL-9对巨噬细胞促炎因子IL-6,TNF-α分泌的影响以及巨噬细胞分泌的IL-9对肝细胞凋亡的影响并探讨潜在的分子机制。实验结果表明,IL-9减少ALI中促炎因子IL-6,TNF-α的产生,抑制酒精诱导的肝细胞凋亡,其抑制肝细胞凋亡作用可能与抑制STAT3通路活化,降低P-STAT3表达相关。本文的体内以及体外实验主要包含以下几个部分:1.建立酒精性肝损伤动物模型以及尾静脉注射腺相关病毒(AAV9)。选用C57BL/6J雄性小鼠为研究对象,通过尾静脉注射腺相关病毒在体过表达IL-9,利用高斌法(NIAAA)即酒精液体饮食建立酒精性肝损伤动物模型。2.IL-9在酒精性肝损伤肝脏组织以及血清中的含量变化。造模结束后,分离得到小鼠肝脏以及血清,利用免疫组化,免疫荧光共定位,Western Blot以及ELISA检测IL-9在酒精性肝损伤中的表达以及定位。实验结果显示,IL-9在酒精性肝损伤模型组中表达显著降低并且与巨噬细胞呈现共定位的现象。3.IL-9对巨噬细胞分泌促炎因子IL-6,TNF-α的影响。实验研究的对象是原代肝脏巨噬细胞和RAW264.7细胞。由ELISA,Western Blot,荧光单染结果显示,IL-9显著降低酒精诱导的巨噬细胞促炎因子IL-6,TNF-α的产生。4.IL-9对酒精性肝损伤中肝细胞凋亡的作用。实验研究的对象是肝脏组织,原代肝细胞,RAW264.7以及AML-12细胞株。由Western Blot结果显示,酒精喂养的小鼠肝细胞凋亡显著增加,腺相关病毒过表达IL-9后,肝细胞凋亡显著降低,肝脏损伤减轻。为了模拟体内环境,我们将巨噬细胞(RAW264.7)条件性培养基加入肝细胞(AML-12)中,继续培养。由Western Blot,Tunel,流式细胞术结果显示,巨噬细胞IL-9显著降低肝细胞凋亡。5.巨噬细胞来源的IL-9抑制肝细胞凋亡作用的相关机制探究。为了进一步探究IL-9抑制肝细胞凋亡作用可能的分子机制,我们在肝细胞(AML-12)中利用si RNA沉默STAT3,然后将巨噬细胞(RAW264.7)条件性培养基加入肝细胞(AML-12)中。由Western Blot结果显示,在酒精性肝损伤中肝细胞IL-9R表达降低,STAT3活化,P-STAT3表达增加。由Western Blot,Tunel结果显示,当肝细胞敲低STAT3,巨噬细胞来源的IL-9降低肝细胞凋亡作用进一步增强。