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背景动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）好发于大中动脉,比如颈动脉、脑动脉、冠状动脉等。颈动脉和脑动脉粥样硬化容易引起脑部供血不足,导致头昏、眩晕、晕厥等症状。冠状动脉粥样硬化最容易引发心肌缺血和心肌梗死,急性心肌梗死最严重的冠心病形式。近年来,AS已成为严重威胁人类健康的疾病之一,且AS发病人群日趋年轻化。尽管AS疾病的死亡率在过去四十年中有所下降,但在35岁以上的人群中,该疾病仍占总死亡人数的三分之一。探索有效的生物标志物对于AS的发现和治疗显得尤为重要。传统的实验方法可以用来探索和验证疾病的发病机制,但它们既耗时又昂贵。目前,新兴的生物信息学利用全球大数据对疾病进行在线网络分析,已证明对疾病的生物标志物筛查和识别是有用的,对筛选后的结果进行实验验证,大大降低了结果的阴性率。在临床上,治疗AS的药物有他汀类、抗血小板聚集类、抗氧化类和抗高血压等,虽然能够有效地改善AS,但具有阻碍正常生理过程和损害肝肾功能两大问题。同时西药的靶点单一,而疾病是多靶点调控,而中药具有多靶点、多环节和双向性的特征。网络药理学通过数据库针对靶点反向分析出有效作用于AS的中药和中药活性成分,这能大大减少实验的时间及成本。生物信息学和网络药理学在很大程度上解决传统的实验方法的弊端并为实验提供有力的基础论证。目的通过生物信息学方法分析AS的差异表达基因,并进行细胞实验验证,为寻找AS的新型生物学标志物提供理论支撑和实验依据。为进一步筛选出治疗AS的中药及中药活性成分,针对该基因靶点进行网络药理学分析进行筛选。方法1.生物信息学筛选出AS的生物学标志物。从GEO数据库中筛选出符合条件的AS芯片数据集GSE28829和GSE66360。应用GEO2R在线工具筛选出差异表达基因并使用DAVID软件对差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）进行功能注释富集分析。应用String及Cytoscape绘制DEGs的蛋白互作网络图并鉴定出hub基因和bottleneck基因,对比DisGeNET数据库中AS相关基因,筛选出疾病候选基因。最后,通过TRRUST和ChEA对候选基因进行其转录因子（Transcription Factor,TFs）的分析,通过 miRTarBase 和 TargetScanHuman对疾病候选基因和TFs进行其mirna的分析,构建mirna-TF-gene网络。2.细胞实验验证mirna-TF-gene信号通路与AS疾病之间的关系。选择人类血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）用于后续体外实验。利用质粒转染的方法,分别转染pcDNA3.1-TF、pcDNA3.1-gene、mirna模拟物、mirna抑制剂及相应的阴性对照,并使用Western Blot和RT-PCR检测VSMCs中mirna、TF、gene的表达情况,CCK-8和Transwell检测VSMCs的增殖和迁移的能力、ELISA检测VSMCs的炎症反应。3.网络药理学分析作用于mirna-TF-gene信号通路的中药及中药活性成分。针对筛选出的mirna-TF-gene信号通路进行反向分析可能作用与AS疾病的相关中药及中药活性成分。结果1.通过生物信息学分析,我们从AS表达数据集GSE28829和GSE66360,筛选出61个DEGs。GO分析显示DEGs主要富集于质膜、胞外间隙、质膜整体结构和炎症、免疫反应过程中的调控。KEGG和Reactome通路富集分析显示DEGs参与破骨细胞分化、血管壁的细胞表面相互作用、趋化因子受体结合趋化因子和FCGR激活。PPI网络分析和Hub基因分析筛选出13个靶基因,包括CSF1R、TYROBP、CD163、CCL3、TREM1、MMP9、FCGR2A、TLR2、FCER1G、AIF1、ITGAX、HCK、FCGR1A。在疾病基因数据库进行对比后发现,MMP9在AS相关疾病中显著上调。进行mirna-TF-gene网络分析发现,miR-491-5p、SMAD3、MMP9互相调控形成一条信号通路。2.细胞实验利用ox-LDL处理VSMCs造AS细胞模型,并在细胞中检测出miR-491-5p的表达水平随着ox-LDL处理浓度的升高而显著降低（P＜0.05）。MiR-491-5p模拟物或抑制物转染到VSMCs后,CCK-8实验和Transwell实验显示,miR-491-5p过表达显著抑制了 VSMCs的异常增殖和迁移（P＜0.05）;qRT-PCR和Western blot实验显示,miR-491-5p过表达抑制SMAD3和MMP9 mRNA和蛋白的表达水平（P＜0.05）;ELISA结果显示,miR-491-5p过表达显著抑制VSMCs中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的释放（P＜0.05）。MiR-491-5p mimic 与 pcDNA3.1-SMAD3共转染后,miR-491-5p的表达水平降低（P＜0.05）,同时MiR-491-5p mimic与pcDNA3.1-MMP9共转染后,miR-491-5p的表达水平降低,但无统计学意义（P＞0.05）。MiR-491-5p mimic 与 pcDNA3.1-SMAD3 或 pcDNA3.1-MMP9 共转染到 VSMCs 后,qRT-PCR 和 Western blot 实验证实,SMAD3、MMP9 的表达水平有一定程度的逆转（P＜0.05）;CCK-8实验和Transwell实验显示SMAD3和MMP9过表达,显著逆转miR-491-5p过表达抑制VSMCs增殖和迁移的作用（P＜0.05）;ELISA 结果显示,SMAD3 或 MMP9 过表达了 VSMCs 中 TNF-α、IL-6和IL-1β的释放显著增加,逆转miR-491-5p过表达抑制的炎症反应（P＜0.05）。3.网络药理学在miR-491-5p/SMAD3/MMP9信号通路的基础上,进行网络药理学分析,发现有240个中草药和11个活性化合物作用于MMP9信号通路,作用于MMP9信号通路的中药药性以温、寒、平为主,功效以清热、解毒、祛湿、化痰、化瘀、活血为主,因此推测出MMP9调控的AS的证型以热邪、毒邪、痰浊、血瘀为主。结论1.生物信息学分析得miR-491-5p/SMAD3/MMP9可能是调控AS的信号通路。2.细胞实验分析得miR-491-5p可抑制VSMCs的异常增殖迁移和炎症反应。miR-491-5p过表达可下调SMAD3和MMP9的表达。SMAD3和MMP9可以反向调控miR-491-5p对VSMCs的异常增殖迁移和炎症反应。3.网络药理学得作用于MMP9信号通路的中药有240种,中药活性化合物有1 1种。分子对接结果显示槲皮素、木犀草素、鞣花酸、黄芩素、川陈皮素、（-）-表没食子几茶素没食子酸酯、尼泊尔鸢尾异黄酮、丹参酮ⅡA、吴茱萸次碱、茵陈色原酮、去氧鬼臼毒素这11个活性化合物与MMP9亲和性高。240味中药的药性以温、寒、平为主,功效以清热、解毒、祛湿、化痰、化瘀、活血为主,推测MMP9调控的AS的证型以热邪、毒邪、痰浊、血瘀为主。余甘子、半枝莲、红花、老鹳草、木蝴蝶、枇杷叶、石榴皮、仙鹤草、灯盏细辛、丹参及前胡存在于1 1个活性化合物的频率最高。