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研究背景HIV-1 是获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的病原体,可侵犯中枢神经系统(central nervous system,CNS),引起一系列神经系统病变,其中最严重的是HIV相关性痴呆(HIV-associated dementia,HAD)。目前为止,HAD具体的发病机制并不明确,但多项研究表明HAD的发生及发展与细胞自噬、凋亡有关。LC3存在于自噬过程中的各个阶段,是目前最常用的自噬标记物,通常研究LC3B-Ⅰ/Ⅱ转化并结合p62蛋白综合判断自噬状态。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate-specific proteases,caspase)在细胞凋亡过程中发挥关键作用,其中caspase-9及caspase-3被认为是细胞发生凋亡的关键酶。HIV-1作为反转录病毒具有高度变异性,中枢与外周环境不同变异也不尽相同,因此HIV-1的变异很可能与HAD的发病机制有关。HIV-1早期负调控因子(negative factor,Nef)是HIV-1的调节蛋白,它通过下调宿主细胞膜表面分子;下调主要组织相容复合物MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ;增强病毒的复制及感染性,促进HIV-1感染的相关脑损伤的发展。目前,有关HIV-1 Nef蛋白对CNS中各种细胞毒性作用的研究较多,但其机制尚未完全阐释清楚。因此,研究Nef蛋白致CNS损伤的机制并进行全面深入的研究,对研究HAD的发病机制具有重要意义。本研究克隆了 HAD(HAD patient,H)及非 HAD 患者(non-HAD patient,N)CNS来源的颞叶(temporal cortex,TC)、外周部位来源的脾脏(spleen,SPL)的HIV-1 nef基因,分析不同来源的Nef蛋白氨基酸位点的差异;研究HAD与非HAD患者中枢与外周部位来源的Nef蛋白对人神经星形胶质瘤细胞系(U87)、人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)活性的影响,进一步研究其对细胞自噬及凋亡的影响,从而为研究HAD的发病机制提供科学依据。方法1.HIV-1 nef基因克隆及氨基酸序列分析以一例HAD及非HAD患者TC、SPL基因组DNA为模板,PCR扩增HIV-1 nef基因,1%琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物,并与克隆载体pMD-19T连接,连接产物转化至大肠杆菌DH-5α,经氨苄青霉素筛选阳性克隆,进行菌液PCR鉴定后测序,所得序列经BLAST比对分析后,使用Bioedit、DNA Man、MEGA6.0等生物学分析软件进行氨基酸位点变异分析。2.pEGFP-N1-nef真核表达载体的构建将 H-TC、N-TC、H-SPL、N-SPL 来源含有nef基因的 pMD-19T-nef重组质粒与真核表达载体pEGFP-N1载体用BamHI和EcoRI双酶切、连接,经琼脂糖凝胶电泳,回收目的基因与pEGFP-N1载体,T4连接酶连接后转化至大肠杆菌DH-5α,经卡那霉素筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定,提取质粒进行酶切和DNA测序鉴定。3.HIV-1 Nef蛋白在U87、SH-SY5Y细胞内的表达及其对细胞活性的影响将构建成功的H-TC、N-TC、H-SPL、N-SPL来源Nef的重组真核表达载体pEGFP-N1-nef转染至U87、SH-SY5Y细胞,pEGFP-N1空载体组为阴性对照,正常细胞组为空白对照,观察绿色荧光判断HIV-1 Nef蛋白表达情况,Western-blot鉴定两种细胞内Nef蛋白的表达,同时用CCK-8试剂盒检测Nef蛋白对两种细胞活性的影响。4.HIV-1 Nef蛋白对U87、SH-SY5Y细胞自噬的影响分别获取对照组及转染48h后的U87、SH-SY5Y细胞,Western-blot检测两种细胞内自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、p62的表达,目的蛋白条带灰度值用ImageJ软件定量分析,分别计算自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、p62/β-actin比值,分析表达不同来源Nef蛋白对U87、SH-SY5Y细胞内自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、p62表达的影响。5.HIV-1 Nef蛋白对U87、SH-SY5Y细胞凋亡的影响(1)DAPI染色观察细胞凋亡将转染pEGFP-N1-nef 48h的细胞固定后加入DAPI染色液染色并置于荧光显微镜下观察凋亡小体,每个样品设置3个平行孔,以pEGFP-N1空载体组为阴性对照,正常细胞组为空白对照,根据细胞核形态变化判断细胞的凋亡情况。(2)凋亡蛋白酶caspase-9、caspase-3含量检测分别收获对照组及转染48h后的U87、SH-SY5Y细胞,Western-blot检测细胞内凋亡蛋白酶caspase-9、caspase-3的含量,目的蛋白条带灰度值用Image J软件定量分析,分别计算caspase-9、3/β-actin 比值,分析不同来源的Nef蛋白对U87、SH-SY5Y细胞内凋亡蛋白酶caspase-9、caspase-3表达的影响。6.统计学分析用SPSS17.0软件对所得实验结果进行统计学处理,实验数据用均数±标准差(x±s)进行描述,采用方差分析进行统计学检验(α=0.05)。结果1.HIV-1 nef基因克隆及氨基酸序列分析成功克隆HAD及非HAD患者TC、SPL来源的HIV-1 nef基因,经BLAST比对分析证实为HIV-1 nef基因序列,并证实两例HAD及非HAD患者感染的是HIV-1 B亚型。与HXB2标准序列比较,氨基酸位点分析结果显示,HAD患者TC同SPL部位均有35个位点发生突变,非HAD患者TC部位有36个位点发生突变,SPL部位有34个位点发生突变。且HAD及非HAD患者CNS和外周的Nef氨基酸突变位点不尽相同,有些氨基酸位点CNS及外周部位都有突变,有的位点突变只发生在CNS,有些位点突变只发生在外周。2.pEGFP-N1-nef真核表达载体的构建双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后回收目的基因与pEGFP-N1载体,连接转化后挑取单菌落进行菌液PCR鉴定及提取质粒双酶切鉴定证实为HIV-1 nef基因,测序结果与HXB2比对正确,证明H-TC、N-TC、H-SPL、N-SPL四组pEGFP-N1-nef真核表达载体构建成功。3.HIV-1 Nef蛋白在U87、SH-SY5Y细胞内的表达及其对细胞活性的影响H-TC、N-TC、H-SPL、N-SPL 来源的 pEGFP-N1-nef真核表达载体转染 U87、SH-SY5Y细胞12h后,在两种细胞内观察到有绿色荧光出现。转染后48h的Western-blot结果显示各实验组约在27kD处有特异性条带,与Nef蛋白预期的大小相符,空载体转染及空白对照未见条带。证明Nef蛋白在U87、SH-SY5Y细胞内成功表达。CCK-8检测结果显示,H-TC、N-TC、H-SPL、N-SPL来源的Nef蛋白对U87细胞活性无明显影响(P>0.05),但明显降低SH-SY5Y细胞的活性(P<0.05),且不同实验组间差异无显著性。4.HIV-1 Nef蛋白对U87、SH-SY5Y细胞自噬的影响U87细胞中,与空白及空载对照相比,H-TC、N-TC、H-SPL、N-SPL组细胞中LC3-Ⅱ蛋白的表达量明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05),且CNS来源的H-TC、N-TC组LC3-Ⅱ蛋白明显高于外周来源的H-SPL、N-SPL组(P<0.05);p62蛋白的表达量有所升高,但各组间差异均无统计学意义(P>0.05)SH-SY5Y细胞中,与空白对照及空载对照相比,H-TC、N-TC、H-SPL、N-SPL组细胞中LC3-Ⅱ蛋白的表达量明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05),且组间差异无显著性;p62蛋白表达量有所升高,但差异均无统计学意义(P>0.05)。5.HIV-1 Nef蛋白对U87、SH-SY5Y细胞凋亡的影响(1)DAPI染色观察细胞凋亡U87细胞中,pEGFP-N1-nef转染细胞48h后,细胞核与对照组相比未见明显变化。SH-SY5Y细胞中,pEGFP-N1-nef转染SH-SY5Y细胞48 h后,细胞核浓染皱缩,染色质聚集,显示典型凋亡细胞的核特征。(2)凋亡蛋白酶caspase-9、caspase-3含量检测U87细胞中,与空白及空载对照相比,表达H-TC、N-TC、H-SPL、N-SPL来源Nef组细胞凋亡蛋白酶caspase-9、caspase-3的表达量无明显变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。SH-SY5Y细胞中,与空白及空载对照相比,表达H-TC、N-TC、H-SPL、N-SPL来源Nef组细胞凋亡蛋白酶caspase-9、caspase-3的表达量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),但不同来源的Nef蛋白各组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.HAD与非HAD患者中枢和外周来源的HIV-1 Nef蛋白存在氨基酸位点的变异。2.HAD和非HAD患者中枢和外周来源的HIV-1 Nef蛋白对U87细胞的活性无明显影响,可抑制U87细胞自噬的晚期阶段,但对细胞凋亡无影响。3.HAD和非HAD患者中枢和外周的HIV-1 Nef蛋白能够降低SH-SY5Y细胞的活性,提示Nef对SH-SY5Y细胞具有毒性作用,可抑制其自噬的晚期阶段,并且诱导细胞发生凋亡。