Rho/ROCKⅡ特异抑制性小分子多肽与TDZD-8促进脊髓损伤后轴突再生的对比实验研究

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目的:(1)对比Rho/ROCKⅡ特异抑制性小分子多肽与TDZD-8对大鼠DRGNs轴突再生的影响;(2)对比Rho/ROCKⅡ特异抑制性小分子多肽与TDZD-8对大鼠脊髓损伤后轴突再生和功能恢复的影响。方法:(1)体外实验:①随机选择健康雌性SD成年大鼠5只,按WD法制成T9平面以下截瘫模型,术后7天取T8-T10节段脊髓,制作截瘫大鼠脊髓提取液;②取新生SD大鼠(<5d)背根神经节经酶解消化、机械吹打、离心、重悬、纯化,进行原代培养观察;③实验分组:A组,DRGNs+60μ1PBS:B组,DRGNs+60μl截瘫大鼠脊髓提取液;C组,DRGNs+60μl截瘫大鼠脊髓提取液+20μl脂质体;D组,DRGNs+60μl截瘫大鼠脊髓提取液+1μMTDZD-8:E组,DRGNs+60μl截瘫大鼠脊髓提取液+20μl脂质体+8μg多肽。在不同环境下共同培养两天后相差显微镜下照相、固定、行免疫荧光,测量神经轴突长度,观察TubulinβⅢ阳性表达以及轴突远端平均荧光密度。(2)体内实验:①取健康成年雌性SD大鼠280只,随机分为7组,每组40只,A组:正常组;B组:假手术组(仅咬开椎板,不损伤脊髓);C组:空白对照组(致瘫后不注射任何药物);D组:PBS液组(经导管注射20u L PBS);E:脂质体组(经导管注射20μ L脂质体溶液);F组:TDZD8组(经导管注射20μ L(1μM)TDZD-8);G组:多肽组(经导管注射脂20μL质体+8μ gROCK2竞争抑制性小分子多肽)。C-G组按WD法制成T9平而以下截瘫模型,并在L4平面蛛网膜下腔植入注药用的软导管,B组仅咬开椎板,不损伤脊髓,A组不作任何处理。术后1h起各组,经导管鞘内注射不同药物,每天一次,共2W。②术后8h、24h、72h、1W、2W行HE染色,观察组织变化情况;③术后8h、24h、72h、1W行TUNEL染色观察细胞凋亡情况;④术后24h、72h、1W、2W行免疫组化,观察GAP-43表达;⑤术后24h、3W、6W、8W作SEP观察潜伏期和波幅;⑥术后第6W行顺行示踪、逆行示踪,观察各组轴突的生长情况;⑦术后3、6、8W作BBB评分。⑧各项统计指标用x±s表示,应用SPSS11.5统计软件作单因素方差分析。结果:(1)体内部分:各组共同培养两天后,平均轴突长度(μm):A组:319.78±51.86,B组:107.59±27.53,C组:101.03±32.37,D组:282.05±45.79,E组:296.57±36.81。各组轴突远端平均荧光密度(AFU/μm):A组:207.95±4.90,B组:66.13±4.45,C组:66.31±6.01,D组:267.81±13.21,E组:309.59±17.08。经单因素方差分析,B、C组分别与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.01),B、C组之间比较无统计学意义(P>0.05);D组与E组之间比较差异有统计意义(P<0.05)。(2)①GAP-43的表达:术后24h(mm2):A组31.11±1.82,B组37.05±1.43,C组42.23±2.89,D组41.98±2.87,E组/42.21±2.37,F组74.33±3.55,G组82.86±3.31;术后72h(mm2):A组31.55±1.37,B组39.65±2.27,C组50.53±2.73,D组52.39±2.52,E组52.18±3.24,F组84.93±4.31,G组94.39±3.49;术后1W(mm2):A组31.13±1.64,B组43.23±2.98,C组64.63±3.45,D组65.31±3.45,E组65.21±3.73,F红组108.76±6.48,G组.113.30±7.38;术后2W(mm2):A组31.11±1.49,B组44.71±3.67,C组53.22±5.45,D组51.51±5.49,E组52.81±4.80,F组157.83±5.02,G组169.37±7.96。在各个时间点,F组和G组生长相关蛋白而积均大于C、D、E组,有统计差异(P<0.01);C、D、E组无明显统计学差异(P>0.05); G组生长相关蛋白面积均大于F组,有统计学差异(P<0.01)。②凋亡细胞数:术后8h:A组7.86±4.45,B组9.33±2.44,C组49.00±5.49,D组49.60±5.11,E组50.53±4.27,F组44.53±3.85,G组39.73±4.06;术后24h:A组8.53±1.41,B组10.20±3.42,C组54.80±5.39,D组54.80±5.41,E组54.67±4.82,F组47.33±3.89,G组42.40±5.45;术后72h:A组8.40±1.90,B组9.27±2.40,C组45.60±3.80,D组46.20±5.63,E组45.87±7.64,F组38.47±4.75,G组31.45±5.07;术后1W:A组7.33±1.59,B组7.73±1.58,C组15.67±2.26,D组15.53±2.26,E组15.47±2.50,F组12.53±3.36,G组10.27±3.15。在各个时间点,F组和G组凋亡阳性细胞数均小于C、D、E组,有统计差异(P<0.05);C、D、E组无明显统计学差异(P>0.05);G组凋亡细胞数均小于F组,有统计学差异(P<0.05)。③顺行示踪荧光而积:损伤节段(mm2):A组220.80±10.39,B,组95.01±5.39, C组34.06±1.78,D组35.96±3.29,E组35.18±2.85,F组76.48±1.11,G组84.68±2.45;损伤节段以下(mm2):A组220.80±10.39,B组73.80±3.49,C组14.18±2.04,D组14.48±3.33,E组14.02±1.71,F组33.46±2.77,G组43.20±1.54。损伤节段及损伤节段以下F组和G组荧光面积均大于于C、D、E组(P<0.05),有统计差异;C、D、E组之间无明显统计学差异(P>0.05); G组荧光面积均大于F组,有统计学差异(P<0.05)。④SEP波幅及潜伏期:各组术前潜伏期(ms):A组14.36±1.94,B组15.98±3.41,C组15.98±1.68,D组16.12±1.29,E组16.06±3.69,F组15.40±2.18,G组16.16±2.30;术后一天各组潜伏期(ms):A组16.10±1.39,B组15.96±3.61,C组37.44±5.12,D组36.84±5.46,E组36.52±4.35,F组35.70±4.45,G组38.30±1.46;术后3W各组潜伏期(ms):A组15.34±1.41,B组16.02±3.85,C组35.94±4.61,D组35.90±5.61,E组35.66±3.99,F组30.42±1.02,G组26.34±0.94;术后6W各组潜伏期(ms):A组14.70±0.82,B组16.24±1.97,C组31.42±2.30,D组31.02±3.44,E组30.74±0.95,F组26.60±1.66,G组23.26±2.81;术后8W各组潜伏期(ms):A组14.38±1.35,B组14.44±1.47,C组28.40±1.05,D组29.03±5.59,E组28.94±4.46,F组23.56±3.45,G组19.10±2.47。术前各组潜伏期均无明显差异(P>0.05),术后24小时C—G组潜伏期和术前有明显统计学差异(P<0.01)。术后3、6、8W,各时间点G组和F组潜伏期均低于C、D、E组,之间有显著统计学差异(P<0.05);C、D、E组之间潜伏期均无明显统计学差异(P>0.05);G组潜伏期均低于F组,之间有显著统计学差异(P<0.05)。各组术前波幅(μV):A组15.30±4.11,B组16.48±4.58,C组15.50±3.04,D组15.32±3.52,E组16.00±3.32,F组17.26±3.23,G组15.60±2.29;术后一天各组波幅(μV):A组15.18±4.05,B组14.98±1.95,C组1.26±0.30,D组1.28±0.61,E组1.16±0.46,F组1.28±0.48,G组1.22±0.43;术后3W各组波幅(μV):A组14.96±3.39,B组16.06±2.99,C组1.46±0.48,D组1.36±0.4,E组1.32±0.56,F组4.88±0.26,G组6.92±0.36;术后6W各组波幅(μV):A组14.96±3.10,B组.16.52±1.29,C组2.62±0.94,D组2.28±0.30,E组2.68±0.58,F组5.48±0.99,G组9.48±3.27;术后8W各组波幅(μV):A组15.14±2.33,B组16.18±3.44,C组2.8±0.82,D组2.94±0.71,E组3.20±0.78,F组6.94±0.36,G组0.07±3.67。术前各组波幅均无明显差异(P>0.05),术后24hC—G组波幅和术前有显著统计学差异(P<0.01)。术后3、6、8W,各时间点G组和F组波幅均高于C、D、E组,之间有显著统计学差异(P<0.05);C、D、E组之间均无明显统计学差异(P>0.05);G组波幅均高于F组,二者之间有显著统计学差异(P<0.05)。⑤BBB评分:术后3、6、8W A、B两组评分均为21分。术后3WC-G组评分为:C组5.0±1.59,D组5.0±2.35,E组5.2±0.84,F组7.6±1.14,G组10.0±2.0;术后6W C-G组评分为:C组5.6±2.07, D组5.8±2.78, E组5.8±1.30,F组9.4±1.82,G组2.0±2.35;术后8W C-G组评分为C组:8.0±1.00,D组8.2±2.17,E组8.0±1.00,F组12.4±1.95,G组15.8±1.92。各时间点G组、F组评分和C、D、E组之间有统计学差异(P<0.01);G组评分大于F组,二组之间有统计学差异(P<0.01);而C、D、E组之间差异无统计学意义(P>0.05)。⑥逆行示踪荧光面积:损伤节段(mm2):A组192.78±6.14,B组93.88±4.12, C组23.86±2.69,D组23.50±1.70,E组24.90±2.25,F组56.16±2.91,G组63.02±3.03;损伤节段以上(mm2):A组192.78±6.14,B组73.88±5.12,C组11.32±1.47,D组11.48±1.39,E组11.64±1.39,F组26.60±2.16,G组31.18±1.49。损伤节段及损伤节段以上F组和G组荧光面积均大于C、D、E组有统计差异(P<0.05);C、D、E组之间无明显统计学差异(P>0.05); G组荧光而积均大于F组,有统计学差异(P<0.05)。结论:(1)Rho/ROCKⅡ特异抑制性小分子多肽能促进DRGNs轴突生长,有利于神经网络的形成,且效果优于TDZD-8.(2)Rho/ROCK Ⅱ特异抑制性小分子多肽能抑制细胞凋亡、减轻继发性脊髓损伤、促进脊髓损伤后轴突再生和功能恢复,且效果优于TDZD-8。
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