【摘 要】
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目的探索转化生长因子β活化激酶1（transforming growth factor-βactivated kinase 1,TAK1）在缺血缺氧脑性瘫痪（cerebral palsy,CP）大鼠模型中的表达及细胞定位情况。通过体外实验研究TAK1与神经免疫微环境和神经元凋亡的相关性及二者间相互影响机制并探讨TAK1可能在缺血缺氧CP的病理生理形成过程中发挥的作用及其意义。方法1.选取7日龄SD
【基金项目】
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江苏省青年医学人才项目课题（QNRC2016410）； 江苏省“六个一工程”拔尖人才项目（LGY2017038和 LGY2020049）； 《江苏省卫生计生委科研项目》,项目名称为《超选择性脊神经后根切断术治疗下肢痉挛状态的基础与临床研究》；
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目的探索转化生长因子β活化激酶1（transforming growth factor-βactivated kinase 1,TAK1）在缺血缺氧脑性瘫痪（cerebral palsy,CP）大鼠模型中的表达及细胞定位情况。通过体外实验研究TAK1与神经免疫微环境和神经元凋亡的相关性及二者间相互影响机制并探讨TAK1可能在缺血缺氧CP的病理生理形成过程中发挥的作用及其意义。方法1.选取7日龄SD大鼠幼仔构建缺血缺氧CP模型,在不同时间点取脑组织标本。通过H＆E染色反映CP模型病理改变。免疫组化探究不同部位中磷酸化的TAK1（p-TAK1）在CP模型中的表达差异;免疫印迹（western blot,WB）分析CP模型大脑皮质组织中TAK1、p-TAK1和凋亡指标表达差异,并通过免疫荧光染色寻找p-TAK1的定位情况。2.体外实验中,通过氧-葡萄糖剥夺（oxygen-glucose deprivation,OGD）和条件培养基（conditioned medium,CM）刺激SH-SY5Y和BV-2细胞构建细胞模型。通过TAK1特异性抑制剂5Z-7-Oxozeaenol药理性抑制TAK1表达。运用WB检测细胞模型中p-TAK1、凋亡指标和炎症指标的表达。LDH释放实验反映SH-SY5Y细胞死亡情况。通过ELISA实验测定BV-2细胞培养基上清液中的促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。通过CCK8实验检测细胞活性,选择5Z-7-Oxozeaenol最适浓度。通过流式细胞术、免疫荧光双标染色及TUNEL染色检测抑制TAK1对SH-SY5Y细胞凋亡的影响,以此进一步研究TAK1在神经元凋亡中的作用。结果缺血缺氧（hypoxia-ischemia,HI）大鼠脑组织标本中,H＆E染色实验证明大脑的不同部位表现出不同程度的损伤差异。免疫组化实验发现CP模型不同部位中p-TAK1水平升高。WB分析发现在CP模型大脑皮质组织中p-TAK1水平升高,促凋亡指标cleaved caspase-3、Bax表达升高,抗凋亡指标Bcl2表达下降。通过免疫荧光发现p-TAK1定位于神经元和小胶质细胞中。体外实验中,WB分析发现SH-SY5Y细胞模型中p-TAK1、cleaved caspase-3和Bax表达升高,Bcl2表达降低,与体内实验结果一致。BV-2细胞模型中p-TAK1、i NOS、IL-1β表达升高,NF-κB信号通路激活。通过TAK1特异性抑制剂5Z-7-Oxozeaenol药理性抑制TAK1表达,调节神经免疫微环境。ELISA实验证明BV-2细胞释放促炎因子减少,LDH释放实验表明神经元死亡减少,流式细胞术、双重荧光染色和TUNEL染色证明OGD直接带来的神经元凋亡和BV-2细胞引发的神经炎症所致的继发性神经元凋亡减少。结论TAK1调节神经免疫微环境,减少缺血缺氧CP模型中神经元凋亡、神经炎症及继发性神经损伤。
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