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背景人源化小鼠模型被认为是目前用于疾病发生发展过程中免疫基础研究和临床前药物评估的最佳工具。然而,该模型的构建效果受细胞来源、植入途径、免疫缺陷小鼠品系和预处理方式等多种因素的影响。目前,建立人源化小鼠模型通常是通过辐照预处理新生免疫缺陷小鼠后,再将人脐带血(UCB)CD34~+造血干细胞(HSCs)经尾静脉注射到体内的方法。但据报道,人UCB-CD133~+HSCs移植后在分化数量和质量上均优于CD34~+HSCs,骨髓腔内注射(IBMI)更适合HSCs发育分化,NOG(NOD Shi-SCID IL-2Rγcnull)小鼠是目前HSCs移植的最佳受体。此外,NOG小鼠对辐射敏感且辐射处理需专用设备和人员,而临床移植常用的预处理药物白消安(Busulfan)是一个较为理想的替代。人源化小鼠免疫系统重建效果依赖于所植入HSCs的数量,更多的HSCs往往能够获得更高的重建水平。但单份UCB中可分离的HSCs数量有限,不能大量构建人源化小鼠模型。若将多份UCB-HSCs构建的人源化小鼠用于同一实验,则很难控制个体差异对实验结果的影响。因此如何通过体外扩增获得大量均质的人HSCs是目前亟待解决的问题。目的通过骨髓注射将人UCB-CD133~+HSCs植入经白消安预处理的NOG小鼠体内,构建具有人免疫系统的人源化小鼠模型;检测小檗碱(Berberine)对人UCB-CD133~+HSCs体外扩增的影响。方法1.将人UCB-CD133~+HSCs植入经白消安预处理的NOG小鼠骨髓腔,构建免疫系统人源化小鼠模型,并评估构建效果;1.1采用Ficoll密度梯度离心法从健康孕妇UCB中分离单个核细胞(MNCs)后,再用磁珠分选法从MNCs中分选CD133~+HSCs。1.2采用流式法检测MNCs中CD133~+HSCs百分比及磁珠分选出的CD133~+HSCs纯度。1.3使用白消安预处理或生理盐水预处理(对照)NOG小鼠,24后将CD133~+HSCs植入小鼠骨髓腔。移植后每周观察记录小鼠行为学变化及存活情况。1.4移植后每隔4周采集NOG小鼠外周血,用流式法检测人免疫细胞分化情况。2.以白藜芦醇(Resveratrol)为阳性对照检测小檗碱对人UCB-CD133~+HSCs体外扩增的影响。2.1使用(0-50)μM白藜芦醇体外扩增CD133~+HSCs 8天,采用MTS法检测细胞增殖活性。2.2使用10μM白藜芦醇体外扩增CD133~+HSCs 0-14天,采用流式法检测扩增前后CD34~+CD133~+细胞比例。2.3使用(0-20)μM小檗碱体外扩增CD133~+HSCs 8天,采用MTS法检测细胞增殖活性。2.4使用(0-20)μM小檗碱体外扩增CD133~+HSCs 8天,采用流式法检测扩增前后CD34~+CD133~+细胞比例。2.5使用(0-10)μM小檗碱体外扩增CD133~+HSCs 6-10天,采用MTS法检测细胞增殖活性。2.6使用(1.25、2.5、5)μM小檗碱与(5、10)μM白藜芦醇联合培养CD133~+HSCs8-10天,采用MTS法检测细胞增殖活性。2.7经(5、10)μM小檗碱、10μM白藜芦醇,(5、10)μM小檗碱与10μM白藜芦醇联合培养CD133~+HSCs 6-8天,采用流式法检测扩增前后CD34~+CD133~+细胞比例。2.8经5μM小檗碱+10μM白藜芦醇、5μM小檗碱及10μM白藜芦醇分别培养CD133~+HSCs 6-8天,采用Q-PCR法检测干细胞转录因子NANOG和SOX-2的相对表达量。结果1.将人UCB-CD133~+HSCs植入经白消安预处理的NOG小鼠骨髓腔,构建免疫系统人源化小鼠模型,评估构建效果。1.1一份人UCB-MNCs中CD133~+细胞百分比为40.7±0.11%,磁珠分选出的CD133~+细胞纯度达93.5±2.12%。1.2移植1周后(1 wpt),白消安预处理组中1只小鼠出现毛发皱褶、驼背、活动逐渐减少及全身触诊强度增加等行为学变化,在4 wpt时死亡。生存分析显示,对照组小鼠存活率(100%)略高于白消安预处理组(83%),但无统计学差异(P>0.05)。1.3在4 wpt时,在NOG小鼠外周血中检测到CD45~+CD19~+细胞和CD45~+CD3~-细胞。白消安预处理组上述B淋巴细胞分化数量及h-CD45~+与m-CD45~+的比值显著高于对照组(P<0.01)。1.4在16 wpt时,检测到人CD3~-、CD19~+、CD3~+、CD4~+和CD8~+细胞。白消安预处理组上述人淋巴细胞分化数量及人CD4~+与人CD8~+细胞的比值均显著高于对照组(P<0.01)。1.5在16 wpt时,还检测到人CD3~-CD19~-CD14~-HLA-DR~+树突状细胞(DCs)和CD3~-CD19~-CD14~+单核细胞。白消安预处理组DCs和单核细胞分化数量分别是对照组的7倍和3倍。2.以白藜芦醇为阳性对照检测小檗碱对人UCB-CD133~+HSCs体外扩增的影响。2.1与对照组相比,10μM白藜芦醇能促进CD133~+HSCs增殖活性(P<0.05),但对CD133~+细胞比例的维持作用显著低于CD34~+细胞(P<0.0001)。2.2与10μM白藜芦醇组相比,高浓度小檗碱(10~20)μM可显著提高CD133~+细胞比例(P<0.0001),但不能提高细胞增殖活性。2.3与10μM白藜芦醇组相比,小檗碱5μM为最佳扩增浓度(P<0.01),5μM小檗碱+10μM白藜芦醇为最佳联合培养浓度(P<0.01),两组均可在提高CD133~+细胞比例的同时促进细胞增殖。而8天为最佳培养周期。2.4与对照组相比,5μM小檗碱在CD133~+HSCs体外扩增8天时显著增加了NANOG及SOX-2基因的相对表达量(P<0.0001),5μM小檗碱和10μM白藜芦醇联合用药效果次之(P<0.05),而10μM白藜芦醇仅在培养8天时可促进SOX-2基因的表达(P<0.05)。结论1.人UCB-CD133~+HSCs可作为建立免疫系统人源化小鼠模型的良好来源,而白消安预处理联合骨髓内注射的方式有利于促进CD133~+HSCs在NOG小鼠体内的分化。2.小檗碱联合SCF、TPO及FLT-3L细胞因子能作为人UCB-CD133~+HSCs体外扩增的有效试剂组合,其最佳浓度为5μM,扩增最大周期为8天。