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研究目的：人微小病毒B19(Human Parvovirus B19)系微小病毒属中唯一能致人类疾病的一种病原体，可引起传染性红斑、再障危象等多种人类疾病。目前尚来建立针对该病毒的特异性疫苗，对人微小病毒B19感染的预防和治疗是急待解决的问题。近年来国外开始把B19的衣壳蛋白作为疫苗抗原进行研究。本课题的目的是利用真核表达质粒pcDNA3.1为载体，将选择出的B19-VP2抗原表位丰富区基因片段重组其中，构建出pcDNA3.1-VP2重组表达载体，并将重组质粒免疫动物，观察其免疫效应，以探讨人微小病毒B19-VP2基因作为基因疫苗的可行性，为最终建立针对该病毒的特异性实用疫苗奠定基础。 方法：从人微小病毒B19的基因序列和结构分析中可获得B19-VP2的氨基酸序列，利用ANTHEWIN和DNASIS软件对B19-VP2的表位进行分析；在此基础上设计出B19-VP2靶区域引物，为了克隆方便和插入方向正确，特意在两条引物上分别加入HindⅢ和BamHⅠ内切酶位点；利用PCR技术从含B19病毒DNA序列的质粒中扩增出VP2基因；将其连接在pGEM-T质粒上，转化JM109，运用pGEM-T质粒的T7／SP6序列设计出引物对连接的正确性进行鉴定，利用AMP抗性对阳性克隆进行筛选，并进行DNA测序，以保证克隆的目的片段的正确性；将重组质粒pGEM-T-VP2和pcDNA3.1同时用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切，电泳纯化后进行亚克隆，转化细菌，再次筛选和鉴定出阳性克隆，并进行DNA测序。大量培养、提取、纯化pcDNA3.1-VP2，肌注家兔，动态采血，ELISA方法测特异性抗体。结果:1.表位分析:通过对VPZ的294一541位氨基酸序列分析，初步确定了9个表位。它们分别是①VNSVSTKEGDSSNT②TGLSTGTS③SLRPGPVSQPYHHWDT④工SHGQTTYGNAEDKEYQ⑤GRFPNEKEQ⑥MHTYFPNKGTQQYTD⑦FLKILPQSG⑧FKLGPRKATGRWN⑨LYDPTATDAKQHHRHGYEK2.靶基因扩增:以含有B19病毒全基因的质粒为模板，利用PCR扩增得到vPZ基因中的靶基因(4168一4968)，共800个碱基对。3.克隆和亚克隆重组子结果鉴定:靶基因与pGEMesT质粒连接后，以T7/SP6作为引物对转化后的质粒进行筛选扩增，得到96ObP的阳性克隆，证实B19一VPZ靶基因成功插入pG甜一T，即得到pGEM一T一VPZ重组质粒。将重组质粒pGEM，T一VPZ和PcDNA3.l同时用Hindlll和B叨Hl酶切后进行亚克隆，以T7/SP6作为引物对转化后的质粒进行扩增，得到 966bP的阳性克隆。证实B19一P2靶基因成功插入peDNA3.1，即得到peDNA3.1一VPZ重组质粒。4.克隆和亚克隆重组子测序结果:对鉴定得到的克隆和亚克隆重组子PGEM-T一VPZ和PcDNA3.1一VPZ进行DNA测序，证实我们所克隆/亚克隆出的VPZ基因片段的碱基组成与公开发表的vPZ序列完全一致，即成功构建pcDNA3.1一vPZ真核表达载体。5，ELISA结果:实验动物的体内产生了高效价的抗B19病毒的工gG抗体。结论:本课题利用分子生物学软件分析出B19一VPZ抗原表位丰富区，确定了9个抗原表位，主要集中于294一541位氨基酸序列中。利用分子生物学的方法，成功构建含B19一VPZ基因的真核表达质粒PcDNA3.1一VPZ。并通过免疫接种，在动物体内产生了较强的免疫应答。通过此项研究，为人微小病毒B19基因疫苗的研制奠定了坚实的基础，并为进一步研究基于VPZ的表位生物学和表位疫苗提供了详实的数据。