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目的通过高分辨率熔解曲线(High Resolution Melt,HRM)法分析不同肿瘤细胞系抑癌基因PTEN的突变状态,探讨PTEN基因在不同肿瘤细胞中的突变频率。运用荧光定量PCR的方法检测PTEN基因在各肿瘤细胞系中表达水平差异,转染改变肿瘤细胞PTEN的相对表达水平探讨其对肿瘤细胞增殖、周期、迁移以及相关免疫分子的表达,并用钙黄绿素法测定健康人CIK细胞对不同肿瘤细胞的杀伤效率,分析不同PTEN相对表达水平对CIK细胞杀伤效率的影响,为今后基于PTEN的肿瘤基因疗法和CIK免疫疗法提供一定的理论依据和参考。方法一、不同肿瘤细胞系抑癌基因PTEN的突变研究按照ATCC中相应细胞的培养方法,培养并收集各肿瘤细胞,基因组试剂盒法提取细胞基因组DNA,设计特异性突变筛选引物,运用HRM分析方法筛选各肿瘤细胞PTEN基因突变的状态,并进一步测序验证HRM筛选结果,分析HRM法筛选肿瘤细胞PTEN基因突变的可行性与准确性,确定各不同肿瘤细胞抑癌基因PTEN的突变频率。二、荧光定量PCR法分析不同肿瘤细胞PTEN表达水平差异的研究培养并收集各肿瘤细胞,提取各肿瘤细胞的总RNA,RT逆转录合成c DNA第一链,采用SYBGreen染料荧光定量PCR法检测各肿瘤细胞PTEN的表达水平,并比较分析不同肿瘤细胞PTEN表达水平的差异。三、PTEN对肿瘤细胞生理特性的影响及其表达水平对免疫相关分子表达的影响通过转染的方式改变肿瘤细胞PTEN的相对表达水平,探讨PTEN表达变化对肿瘤细胞增殖、迁移、周期的影响;运用RT-PCR及琼脂糖电泳半定量的方法分析肿瘤细胞PTEN转染前后不同PTEN表达水平与P38MAPK,协同刺激分子CD80/86,B7-H1,B7-H4,以及趋化因子受体CCR6和CCR7表达水平之间的变化关系,为探讨PTEN表达水平差异对CIK杀伤敏感性的影响奠定基础。四、健康人CIK细胞对不同肿瘤细胞杀伤效率差异及与不同肿瘤细胞不同PTEN相对表达水平关系的研究钙黄绿素法测定健康人CIK细胞作用于各不同肿瘤靶细胞的杀伤效率,比较CIK细胞对不同肿瘤靶细胞杀伤效率的差异,并分析CIK细胞杀伤效率与肿瘤靶细胞PTEN相对表达水平的相关性,真核表达质粒pc DNA3.1-PTEN转染Hep G2和Hela肿瘤细胞,比较转染前后CIK细胞对其杀伤效率变化,探讨肿瘤靶细胞PTEN表达变化对CIK细胞对其杀伤敏感性的影响。结果一、各肿瘤细胞系抑癌基因PTEN序列基本正常,较少发生突变。利用HRM法筛选多种不同来源肿瘤细胞PTEN基因突变频率,并且通过sanger法测序验证HRM筛选结果的准确性,结果发现几乎所有肿瘤细胞PTEN基因均呈野生型表达,基因碱基序列与NCBI公布序列(Gen Bank:AH007803.1)完全一致,HRM筛选只发现Jurkat细胞系熔解曲线与其他细胞熔解曲线存在较明显差异,通过TA克隆测序进一步验证了Jurkat细胞系PTEN基因为部分碱基增加突变,测序结果也证明了HRM筛选肿瘤细胞PTEN基因突变的可行性和准确性。二、各不同肿瘤细胞系PTEN相对表达水平存在差异。提取各肿瘤细胞总RNA,Oligo(d T)逆转录合成c DNA,荧光定量PCR检测各样本PTEN m RNA转录水平,结果发现不同肿瘤细胞PTEN相对表达水平差异大小不一,部分存在较明显差异,且与正常人PBMC相比均表达偏低,不同肿瘤细胞不同PTEN表达水平可以为研究PTEN对肿瘤细胞生理活性及CIK对肿瘤细胞免疫反应影响的不同提供基础依据。三、转染提高肿瘤细胞PTEN相对表达水平可以抑制肿瘤细胞增值,阻滞周期运转,减慢肿瘤细胞迁移修复速度,并且可以改变肿瘤细胞免疫相关分子的表达转染Hep G2和Hela细胞使其过表达PTEN,MTT法测定转染前后细胞活力变化,结果证明过表达PTEN可以降低肿瘤细胞增值活力,抑制肿瘤细胞增殖;PI染色法测定转染前后细胞周期变化,结果说明PTEN可以使肿瘤细胞发生G0/G1到S期细胞周期阻滞;划痕迁移修复法测定过表达PTEN对肿瘤细胞迁移修复能力的变化,结果证明过表达PTEN可以削弱肿瘤细胞迁移修复能力。RT-PCR半定量法比较PTEN转染前后Hep G2和Hela细胞的PTEN相对表达水平与P38、CD80/86、B7H1、B7H4、CCR6、CCR7相对表达水平关系,结果证明PTEN表达水平不同可以影响P38、CD80/86、B7H1、B7H4、CCR6、CCR7的表达变化,PTEN影响肿瘤细胞的生理特性及相关免疫分子表达为进一步研究肿瘤细胞PTEN相对表达对CIK对其杀伤效率的影响提供理论依据。四、健康人CIK对不同肿瘤靶细胞杀伤效率差异不同,并与肿瘤靶细胞自身PTEN相对表达水平呈负相关性诱导成的健康人CIK细胞以不同肿瘤细胞为靶细胞,钙黄绿素法测量杀伤效率差异,结果发现健康人CIK细胞对不同肿瘤靶细胞杀伤效率存在差异,并且相关性分析说明CIK细胞杀伤效率与肿瘤靶细胞PTEN相对表达水平之间呈现出明显负相关(P<0.05),进一步研究构建重组表达体系pc DNA3.1-PTEN转染肿瘤细胞改变PTEN相对表达水平,发现改变肿瘤靶细胞PTEN表达水平后CIK对其的杀伤效率出现了下调的趋势。结论成功建立HRM筛选肿瘤细胞PTEN基因突变的方法,鉴定了各肿瘤细胞PTEN基因的突变频率和表达水平差异;证明了PTEN可以抑制肿瘤细胞增殖,阻滞周期运转及削弱肿瘤细胞迁移修复,并进一步证明了PTEN表达水平差异可以影响肿瘤细胞相关免疫分子的表达;证明了CIK细胞对不同肿瘤靶细胞杀伤效率存在差异,发现并证实了CIK细胞的免疫杀伤效率与肿瘤靶细胞PTEN的相对表达水平存在负相关。