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目的分析hfq基因对宋内志贺菌的毒力和耐药的调控作用,通过RNA-Seq技术筛选hfq依赖性sRNA,筛选出与毒力和耐药相关的sRNA,为防治志贺菌感染性疾病提供新的思路和药物靶点。方法1.λ-Red同源重组方法构建宋内志贺菌hfq基因敲除株。2.HeLa细胞侵袭实验和小鼠竞争性肺侵袭实验检测宋内志贺菌野生株和hfq基因敲除株毒力差异。3.微量肉汤稀释法检测宋内志贺菌野生株和hfq基因敲除株对氨苄西林、卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星、氯霉素、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、氨曲南、磺胺甲恶唑、亚胺培南、美罗培南、多粘菌素B和美西林14种常用抗生素的最低抑菌浓度。4.对宋内志贺菌野生株、hfq基因敲除株进行转录组测序,利用Rockhopper软件对宋内志贺菌sRNA进行预测,用RNAhybrid和RIsearch软件对差异sRNA进行靶基因预测,通过分析靶基因的功能筛选出与宋内志贺菌毒力和耐药相关的 sRNA。5.提取宋内志贺菌野生株、hfq基因敲除株的RNA,对ompC、ompF、gadA、gadB、hdeA、hdeB、PhoP、sRNA1043、sRNA8、sRNA9、sNA1203、sRNA372、sRNA841、sRNA330和sRNA912等差异基因进行qPCR验证。结果1.成功构建宋内志贺菌hfq基因敲除株:WT/Δhfq。2.HeLa细胞侵袭实验发现WT/Δhfq:kan对HeLa细胞的侵袭力较WT弱,侵袭指数小于1(P<0.001);小鼠竞争性肺侵袭实验中发现WT/Δhfq:kan对Babl/C小鼠肺的侵袭力较WT弱,侵袭指数小于1(P<0.001)。hfq基因的缺失导致宋内志贺菌的毒力因子ipah9.8,耐酸基因gadA、gadB、hdeA、hdeB,以及双组分系统传感器组氨酸激酶envZ、双组分信号转导系统PhoP/PhoQ的表达量发生改变,进而调控宋内志贺菌的毒力。3.WT/Δhfq对卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星、氯霉素、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、氨曲南、磺胺甲恶唑抗生素的最低抑菌浓度较WT降低,对氨苄西林、多粘菌素B、亚胺培南、美罗培南、美西林等抗生素的最低抑菌浓度未发生改变。hfq基因的缺失导致TolC基因和外膜孔道蛋白OmpC和OmpF表达量发生变化,进而调节宋内志贺菌的耐药性。4.本研究预测的宋内志贺菌耐药相关的sRNA是sRNA1043、sRNA1065、sRNA8、sRNA9、sNA1203、sRNA1128、sRNA372、sRNA841 和 sRNA912,它们的靶基因参与生物膜的形成,细胞膜的组成和通透性。5.本研究预测的宋内志贺菌毒力相关的sRNA是sRNA1043、sRNA1065和sRNA330,它们的靶基因参与调控细菌脂多糖的组成和致病性。结论1.RNA伴侣分子Hfq可以调控宋内志贺菌的耐药性和毒力:hfq基因敲除后对头孢菌素类、氨基糖苷类、氯霉素、氨曲南、磺胺甲恶唑等抗生素的敏感性有所上升,对碳青霉烯类、多黏菌素B等抗生素的敏感性无变化;hfq基因的缺失导致宋内志贺菌的毒力明显减弱。2.hfq基因可以通过调控毒力因子、耐酸基因、双组分系统的转录水平来调控宋内志贺菌的毒力;通过调节外排泵系统和外膜孔蛋白的转录来调控宋内志贺菌的耐药性。3.本研究预测的耐药相关的sRNA是sRNA1043、sRNA1065、sRNA8、sRNA9、sNA1203、sRNA1128、sRNA、372、sRNA841和sRNA912。本研究预测的毒力相关的 sRNA 是 sRNA1043、sRNA1065 和 sRNA330。