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目的研究siRNA(small interfering RNA,siRNA)对WT1基因的抑制作用,构建WT1基因siRNA载体,为进一步探讨WT1在白血病中的生物学功能及白血病的基因治疗奠定基础。方法设计制备多对针对WT1基因的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA),通过阳离子脂质体Lipofectamine 2000转染乳腺癌细胞株MCF-7细胞,流式细胞仪检测转染效率,采用实时定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, RQ-PCR)法测定WT1及内参β-actin mRNA的表达,筛选出最有效的siRNA,Western Blot测定WT1蛋白的表达。用不同浓度的最有效的WT1siRNA转染MCF-7细胞,观察不同浓度siRNA对RNAi效应的影响。用10nmol/L浓度的最有效siRNA转染MCF-7细胞后,继续培养24、48、72、96和120h收集细胞进行检测分析,观察RNAi效应的持续时间。并用流式细胞仪(FCM)检测WT1被干扰后,MCF-7细胞对长春新碱诱导凋亡的敏感性。根据最有效的siRNA序列,设计合成两条shRNA(small hair RNA, shRNA)的DNA模板单链,同时模板链两端分别设计不同的两个限制酶切位点。退火形成siRNA载体插入片断。用限制性内切酶将siRNA空载体线性化,T4连接酶将插入片断插入siRNA空质粒中。经酶切、PCR和测序的方法鉴定质粒是否成功。通过脂质体将装有WT1的干扰质粒和阴性对照质粒转入K562细胞中,以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,用流式细胞仪和荧光显微镜观察转染效率和G418筛选4周后质粒表达效率。RT-PCR检测WT1基因表达变化,采用台盼兰拒染法、MTT比色法、甲基纤维素集落形成实验检测WT1基因干扰后对K562细胞生长的影响。通过流式细胞仪测定AnnexinV结合力观察WT1基因干扰后对K562细胞诱导凋亡的作用。结果①脂质体转染MCF-7细胞的效率均值为98.1%(97.2～98.7%),所设计的8对siRNA中,4对能抑制WT1基因的表达,抑制效率在17.3%~89.79%之间。②5、10、50、100、150和200nmol/L浓度的siRNA转染MCF-7细胞后,干扰效率分别为91.00%、91.98%、81.52%、73.02%、77.53%、42.97%;在10nmol/L浓度siRNA作用下,可维持RNAi效应至少4天时间。③流式细胞仪测定Annexin V结合力的方法观察WT1基因被干扰后对长春新碱的诱导凋亡作用的敏感性,对