鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国南方及东南亚地区常见的一种恶性肿瘤,尤以广东省珠江三角洲一带多见,故有“广东瘤”之称。尽管鼻咽癌对放疗敏感,但由于鼻咽部淋巴组织丰富,易于早期转移,对化疗不敏感,转移及治疗后复发仍是鼻咽癌死亡的主要原因。因此,鼻咽癌发生发展,特别是鼻咽癌转移的机制仍是亟待解决的问题。然而即使同一克隆来源的肿瘤,也存在肿瘤细胞表型和功能的异质性,即肿瘤细胞存在增殖能力和分化能力的异质性。肿瘤干细胞学说认为肿瘤细胞内存在一群具有干细胞性质的细胞,具有自我更新及多向分化潜能,将这一部分细胞移植后能够重新形成肿瘤。肿瘤干细胞理论为肿瘤的起源提出了全新的阐述,肿瘤组织中存在极少量的细胞充当干细胞角色,它们具有自我更新和多向分化潜能,是肿瘤发生、发展、转移、复发、对抗放、化疗的根源,肿瘤干细胞学说也得到越来越多证据的支持。然而分离和纯化肿瘤干细胞,仍然是肿瘤干细胞研究的瓶颈问题。目前,鉴定肿瘤干细胞最权威的方法是确定肿瘤干细胞的特异细胞表面标志,并根据这些标志分离出肿瘤干细胞。近些年来,根据细胞表面特异性标志已经鉴定出了多种肿瘤的肿瘤干细胞。白血病干细胞是最早被发现的肿瘤干细胞,研究发现急性髓性白血病(AML)细胞中具有CD34~+CD38~-的细胞具有分化和增殖能力,注射入NOD/SCID小鼠,能促发人急性髓性白血病。CD133是继CD34之后新发现的又一重要的造血干/祖细胞表面抗原标志。随后,CD133作为一种干细胞标记物在多种实体肿瘤,如肝癌、结肠癌、脑肿瘤、肺癌和前列腺癌及B16黑色素瘤等肿瘤中得到证实,CD133在实体瘤干细胞的研究中起着十分重要的作用,大量研究发现,CD133~+肿瘤细胞与肿瘤发生、侵袭、转移、耐药及复发有着密切的关系。Singh等证实脑肿瘤中CD133~+细胞有显著的增殖能力、自我更新能力和分化能力,将少至100个CD133~+细胞接种到NOD/SCID小鼠脑组织就能形成肿瘤,传代后能够连续接种,而且在NOD/SCID小鼠组织中形成肿瘤与患者原发肿瘤表型相同;CD133~-细胞多达1×10~5个细胞不能形成肿瘤。O’Brien等将结肠癌组织中的CD133阳性细胞移植到NOD/SCID小鼠肾被膜下,发现所有结肠癌CIC都是CD133阳性细胞而那些CD133阴性细胞没有致瘤性。Hoechst33342是一种可以穿透细胞膜与DNA结合的染料,侧群(sidepopulation,SP)细胞是指某些细胞具有将细胞的荧光染料Hoechst33342排出,表现为细胞核不着色或着色程度很低的特性,目前的研究认为SP表型的形成与ATP结合组件蛋白G亚家族成员2(ABCG2)有着最直接的关系。而利用该特性分离的细胞称为SP细胞。近年的大量研究指出干细胞或某些前体细胞具有SP的表型。目前,已经从许多人和动物模型的正常组织及肿瘤组织和肿瘤细胞系分离得到了SP细胞,并证实其具有干细胞特性。因此,利用SP表型也成为干细胞分离研究常用的方法。但是,随着研究的进一步深入,也有实验证明,不是所有的SP细胞都是干细胞,SP细胞与干细胞之间也存在差异。在鼻咽癌的研究中,鼻咽癌干细胞的存在已经得到证实,Zhang等利用Brdu标记滞留细胞(label-retaining cells,LRCs)证实鼻咽粘膜基底部有散在的LRCs;Wang等利用Hoechst 33342在NPC细胞株CNE2中分离出类似干细胞的侧群细胞,且认为CK19可能是NPC干细胞的标志物。CD133作为上皮和间叶正常及肿瘤干细胞的重要标志物,在多种肿瘤中已证实其与肿瘤的发生、发展、复发、转移与耐药密切相关。但是,CD133与鼻咽癌的关系目前还知之甚少,CD133在鼻咽癌细胞的表达情况如何,鼻咽癌CD133~+细胞的生物学行为与CD133~-细胞有何不同,以及鼻咽癌细胞CD133与SP表型之间的关系,目前尚不清楚。因此,探讨鼻咽癌发病与转移的机制,为鼻咽癌临床治疗提供新的靶向治疗的靶点,对提高鼻咽癌患者的生存率有实际意义。为此本课题进行了如下研究:1.利用流式细胞仪检测并分离出鼻咽癌细胞株中的CD133~+与CD133~-细胞,激光共聚焦及流式细胞术检测分选纯度,然后通过体外实验比较CD133~+细胞与CD133~-细胞自我更新、增殖、分化、迁移能力2.流式细胞仪分析鼻咽癌细胞株中SP细胞与CD133~+细胞的关系。方法1.流式细胞仪检测鼻咽癌细胞株CD133的表达利用流式细胞术检测CD133在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2中的表达情况。2.细胞的分选与纯度鉴定利用流式细胞仪根据细胞表面标志物分选出CD133~+与CD133~-细胞,流式细胞仪以及激光共聚焦技术对所分选的细胞进行纯度鉴定3.CD133~+细胞生物学功能分析1)通过体外MTT检测法、平板克隆形成实验比较CD133~+与CD133~-细胞的体外自我更新与增殖能力。2)分化潜能的测定:分选出来的CD133~+细胞进行体外培养,培养的过程中利用流式细胞仪与激光共聚焦技术检测CD133~+细胞比例的变化。3) Transwell体外迁移试验及划痕试验分析CD133~+与CD133~-细胞的迁移能力。4.流式细胞仪分析CD133~+细胞与SP细胞的关系结果(一)流式细胞仪检测CD133在鼻咽癌细胞株中表达采用流式细胞术检测了5-8F、6-10B、CNE1、CNE2等4种鼻咽癌细胞株中CD133的表达情况,4种细胞株中CD133的含量都恒定在0.1%-0.2%。(二)细胞的分离及纯度鉴定以CNE2细胞株作为研究对象,利用流式细胞仪分选出CD133~+与CD133~-细胞,利用激光共聚焦及流式细胞仪检测所分选的细胞的纯度,两者结果显示所分选的CD133~+细胞纯度达到98%以上,这为进一步研究其生物学功能奠定了基础。(三) CD133~+细胞生物学功能的鉴定流式细胞仪分选出CD133~+与CD133~-细胞,体外实验检测其增殖、迁移与分化潜能:1.采用MTT法与平板克隆形成试验检测细胞的体外增殖情况,MTT结果显示,与CD133~-细胞相比,CD133~+细胞的增殖能力明显增强,两者具有显著性差异(F=115.545,P=0.000)。平板克隆形成实验的结果显示,CD133~+细胞体外培养形成克隆的速度及形成的克隆数明显高于CD133~-细胞,两者具有显著性差异(t=19.069,P=0.000)。2.分化潜能的测定1)分选后的CD133~+细胞在含血清培养基条件下培养,激光共聚焦显微镜下观察,第1天镜下视野见98%以上分选的CD133~+细胞胞膜发出红色的荧光,第2天细胞贴壁培养后重新标记抗体检测,结果在视野下基本检测不到荧光信号。2) CD133~+细胞体外培养1周,分别在第0、2、5、7天利用流式细胞仪检测CD133~+细胞的比例,培养至第2天,CD133~+细胞的比例由原来的98%迅速下降至0.1%,降到与未分选时阳性细胞比例一致。3.体外迁移能力分析Transwell结果显示,细胞培养24h后,CD133~+细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数明显多于CD133~-细胞,两者具有显著性差异(t=8.352,P=0.001);划痕试验也显示,划痕后培养至48h,肉眼可见CD133~+细胞向划痕区迁移的细胞数多于CD133~-细胞。4.流式细胞仪分析CD133~+细胞与SP细胞的关系流式细胞仪检测结果显示,鼻咽癌细胞株CNE2中可检测到SP细胞亚群,加入verapamil抑制后SP细胞亚群的比例由0.8%下降至0.1%,且CNE2细胞中CD133~+细胞不具有SP表型,CD133~+细胞为非SP细胞。结论1.鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2存在CD133的微量表达,其比例在恒定在0.1%-0.2%。2.利用流式细胞仪高速分选技术可以成功地获得CD133~+细胞,经鉴定阳性细胞分选的纯度达到98%以上,为进一步研究CD133~+细胞的生物学功能奠定了基础。3.CD133~+细胞与CD133~-细胞的体外生物学功能存在明显差异,CD133~+细胞具有自我更新、生成其他表型肿瘤细胞等干细胞样特性。4.CD133~+细胞体外迁移能力明显高于CD133~-细胞,提示CD133可能与鼻咽癌细胞的转移有关。5.鼻咽癌CNE2细胞株中可检测到SP细胞亚群,加入verapamil抑制后SP细胞亚群的比例由0.8%下降至0.1%,CD133~+细胞不具有SP表型,CD133~+细胞为非SP细胞。