白发作为临床常见的一种毛发色素障碍性疾病,虽不会引起严重躯体疾病,但对患者的自信心和社会认同度有极大影响,可严重影响患者的生活质量。随着人们生活节奏的加快和生活压力的增加,白发患者的发病年龄不但呈现出低龄化趋势,其发病率也呈现出上升趋势。伴随着人们生活水平和对自我形象要求的提高,越来越多的患者开始寻求白发变黑发的治疗方法。临床中最为常见的白发类型是老年性白发和过早性头,患者目前主要通过染发剂上色来改变头发颜色,该法不但存在着损伤发质、易于过敏、致癌和部分人群不适用的弊端,其疗效也十分有限。众所周知,人体内毛发的颜色取决于毛囊中黑素细胞所分泌的黑素颗粒数量和类型。毛球部的黑素细胞如出现数量减少或功能障碍常可引起黑素颗粒数量的减少,从而导致白发的发生。毛囊无黑素黑素细胞存在于毛囊外根鞘部位,对毛发着色过程有着重要影响。在胚胎发育过程中,成黑素细胞从神经上皮迁出,经过一系列周期性的迁移和增殖,最终定位在表皮和毛囊当中。在鼠孕期的10.5-13.5天,成黑素细胞迁移至表皮,孕14.5天迁入发育的毛囊,出生后仅位于毛囊中。胚胎期毛囊中的成黑素细胞分化成两个族群：一类是位于毛基质中的成熟黑素细胞(PDMC),另一类是位于毛囊隆突区的黑素干细胞(McSC)。在成年人的毛发周期中,隆突部位的McSC可在外界信号的刺激下向下迁移至毛囊外根鞘并分化成无黑素黑素细胞(AMMC)；随后,AMMC在外界信号的刺激下进一步向下迁移至毛球部并分化成成熟黑素细胞。其中McSC仅表达Dct+、Pax3+、Sox10、AMMC是一种低分化状态的黑素细胞,具有较低的黑素颗粒合成能力,无着色功能,不与酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白Ⅰ、Ⅱ受体抗体反应；PDMC是一中Dct+、Kit+、Mitf、 Pax3+、Sox10+.tyr+、TRP-1+、TRP-2+、Mclr+的成熟黑素细胞,具有较强黑素颗粒的合成能力,主要负责毛发的着色。AMMC具有细胞体积小、多呈双极性的特点,黑素合成能力较低,在体外培养具有增殖和分化成为PDMC的能力。PDMC具有细胞体积大、呈树突状外形的特点,处于高分化状态,在体外培养过程中无增殖分化能力,但具有合成黑素颗粒的能力。黑素细胞中,负责黑素合成分泌的特殊细胞器称为黑素小体。根据其特性,黑素小体有四个分型：Ⅰ型为多泡核内体,以含有丰富双层平面网格蛋白为特征；Ⅱ型的典型特征是形成特定排序加工的有条纹状黑素小体前体；Ⅲ型黑素小体开始合成黑素,内部有明显可见的光条纹；Ⅳ型是成熟的完全着色的黑素小体,聚积在细胞树突中。AMMC中含有丰富的Ⅰ期、Ⅱ期黑素小体,偶尔可观察到Ⅲ期黑素小体,不含有Ⅳ期黑素小体,PDMC中含有Ⅰ～Ⅳ型黑素小体。毛发着色和表皮着色的最大区别在于：毛发着色是随着毛发生长周期变化的更替过程,而表皮着色是一个连续发生的过程。毛发着色的过程主要发生在毛发生长期的初期,此时黑素干细胞增殖分化成两种黑素细胞类型：定位于外毛根鞘的AMMC和定位于毛球部的PDMC。在毛发生长期的Ⅲ/Ⅳ期,毛球部的PDMC大量聚集,黑素大量合成,毛干着色发生。这一着色过程持续到生长期Ⅴ/Ⅵ期,停止于退行期早期。在退行期Ⅱ期毛球部PDMC发生凋亡,持续到退行期Ⅶ期凋亡殆尽,能观察到黑素碎片。健康人毛发着色一直重复这一过程,在大约第十个毛发生长周期(40岁左右)这一个过程发生变化,毛球部黑素细胞数量减少、活性减弱,不能维持长时间的生长期毛发着色,因而逐渐产生白发[l1]。毛发着色过程如下：在毛囊生长期初期,黑素细胞能够合成黑素,通过树突状突起将黑素转运至邻近的毛干皮质和髓质。进入退行期后,黑素细胞发生老化甚至凋亡,黑素合成停止,树突亦逐渐消失。上皮、间质和神经外胚层相互作用,共同调控着毛囊黑素细胞的代谢和毛干的着色。在黑素转运过程中,黑素细胞的树突起吞噬、聚集黑素小体并通过吞泡吐泡作用将其转运至邻近上皮细胞的作用。这些上皮细胞与黑素细胞一样能够吞噬、聚集黑素小体,区别在于这些上皮细胞并不发生退化。影响诱发白发的因素多种多样,比如：干细胞龛微环境的改变,活性氧及机体内神经内分泌因子水平的变化均可诱导产生白发。然而,在白发发生过程中AMMCs比毛囊中任何类型的黑素细胞都要不敏感,受到更多保护,存活时间更长。因此,无黑素黑素细胞是研究毛发着色及白发复色治疗最好的细胞模型。本课题的研究主要包括以下两个方面：1,比较FIUE结合酶消化方法与几种不同的无黑素黑素细胞的体外培养方法由于毛囊是易于获取的组织,并含有近12%的干细胞,在再生医学中,毛囊为自体细胞疗法治疗烧伤患者、白癜风的复色治疗、或促进慢性溃疡的愈合甚至神经再生有着重要作用[14-211。毛囊的黑素细胞分为两种类型：分布在漏斗部和毛球部的色素化树突状黑素细胞(PDMC),及存在毛囊中下部外毛根鞘的无黑素黑素细胞(ANMC)。 PDMC已高度分化,增殖能力有限,外毛根鞘来源的AMMC分化程度低,增殖潜力大。因此,AMMC的体外培养模型可以作为研究白发、白癜风等色素障碍性疾病的发病机制的基础,也可以用来筛选治疗这些疾病的药物和方法。[目的]比较不同的无黑素黑素细胞的体外培养方法。[方法]采用FUE毛囊钻取技术,加上优化的酶消化方法,配以sincecell黑素细胞培养基培养获取无黑素黑素细胞。实验分为三组,每一组五个培养样本,每个培养皿放置30个分离消化毛囊进行培养。实验分为三步：第一步,单纯酶消化步骤过程复杂,为了优化便捷获取单位毛囊过程,结合FUE毛囊钻取技术,讲酶消化步奏从三步简化至一步,大大缩短酶消化时间。第二步,在优化的单位毛囊获取方法的基础上,摸索最适宜的酶消化时间,缩短细胞迁出时间并提高细胞迁出率。第三步,对比直接拔取法、酶消化法及FUE+酶消化法：同一批次的毛囊,使用三种不同方式获取,放置在一样的培养条件下,比较得出FUE+酶消化法培养的毛囊细胞迁出率要高于直接拔取法及单纯酶消化法,且细胞迁出时间更短。将培养出的细胞通过免疫荧光和透射电镜的方法进行鉴定。[结果]l,FUE+酶消化法的细胞迁出时间明显短于直接拔取培养法及传统酶消化法,且细胞迁出率明显增加。2,配以FUE及酶消化的培养方式,可以简化没消化步骤,可以节省近一半的酶消化时间及经济成本。3,FUE钻取的毛囊最佳消化时间在30min左右。结合FUE结合Ⅳ型胶原酶酶消化30min的方式,外毛根鞘细胞在3-5天开始迁出,10天左右迁出达到高峰。细胞培养周期由原来普遍认为的4周,缩短至不到3周。因此,本实验的优化培养方式能够更快的更便捷的获得无黑素黑素细胞。是是S100B、NKI/beteb免疫荧光鉴定结果为阳性,透射电镜观察结果可观察到黑素小体。[结论]FUE可以节省显微分离单位毛囊的时间,提高显微分离的效率,并且简化了酶消化的步骤。较之显微分离的物理损伤、长时间暴露损伤,及单纯酶消化的多重酶消化时间过长对获取的毛囊的损伤更小,活性更强。2,观察无黑素黑素细胞体外培养过程的形态变化,及低氧干预对无黑素黑素细胞的影响。毛囊中黑素细胞家族主要分为三类：一是存在毛囊隆突区域的黑素干细胞,此类细胞具有分化能力,作为毛发生长周期中黑素细胞的补给来源；二是位于外毛根鞘的AMMC,具有细胞体积小、细长且多呈双极性的特点,黑素合成能力低,在体外培养具有很强的增殖能力；再是位于毛球部的PDMC,包饶这毛乳头,混杂在毛母质当中,具有细胞体积大、胞体呈树突状多极性的特点,处于高分化状态,在体外培养过程中几乎无增殖分化能力,但具有合成黑素颗粒的能力。[目的]观察无黑素黑素细胞在体外培养过程中形态变化及探寻低氧培养对黑素细胞的作用。[方法]采用FUE+酶消化培养出的无黑素黑素细胞,进行传代培养。实验分为两大部分：第一,记录0、1、3、5、7代细胞的形态变化过程,拍摄并记录。将形态发生变化的细胞做免疫荧光染色,鉴定其细胞特性的改变。第二,将同一批次的第3代无黑素黑素细胞做划痕处理分为两部分,一部分放入含5%氧含量的低氧培养箱。观察两部分细胞,划痕实验的一个变化,分0、6、12、24小时观察细胞变化,取样并拍照,根据划痕恢复时间差别比较两种条件下细胞增殖及迁移能力的不同。同时在两种培养箱中,传代培养细胞,比较两批细胞的一个形态变化有无差别,观察不同培养环境对细胞形态及特性的维持作用。[结果]1,无黑素黑素细胞在培养过程中,细胞形态由双极性向树突型变化,第6代细胞开始,两种细胞类型的主导地位发生颠覆,将第6、9代,进行HMB45抗体免疫荧光染色,发现阳性结果的细胞。而无黑素黑素细胞作为黑素细胞前体,在原代培养获得时HMB45抗体的染色是阴性的。HMB45抗体阳性表达在黑色素瘤及成熟黑素细胞中。说明无黑素黑素细胞在培养过程中是在逐渐成熟和分化的。2,在低氧细胞培养箱中,细胞划痕实验的恢复时间明显短于普通细胞培养箱的细胞,且无黑素黑素细胞形态基本不发生形态变化。[结论]无黑素黑素细胞在体外培养过程中,会进行分化、成熟,从不具备着色能力的黑素细胞前体,演化为成熟黑素细胞,也许这正是其作为黑素细胞库的来源的原因。低氧培养环境给予了无黑素黑素细胞一个更好的拟生态环境,更好的维持了细胞特性及其活性。