C/EBPβ在SLE患者外周血单一核细胞中表达及其调节的初步研究

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研究背景:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种涉及多种免疫过程的自身免疫性疾病,其主要特点为自身抗体的产生,持续性的慢性炎症反应及多个靶器官器官损伤。对于其病因目前尚未明确。越来越多的研究关注到天然免疫在SLE疾病发病机制中的作用。其中Toll样受体可以通过识别自身核酸、激活核转录因子kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)及其他炎症信号通路来促进加重SLE。许多调节或介导炎症的因子参与Toll样受体信号通路,包括CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding proteinβ,C/EBPβ),肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(tumor necrosis factor alpha-induced protein 3,TNFAIP3)及TNFAIP3相互作用蛋白1(TNFAIP3interacting protein1,TNIP1)。C/EBPβ是一种真核细胞转录调控因子,在细胞分化、肿瘤发生、免疫反应等多种生理和病理过程中具有重要作用。TNFAIP3及TNIP1基因通过全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)被鉴定为SLE易感基因,已经证实多个种族人群中TNFAIP3和TNIP1多个位点的单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms,SNPs)与SLE的遗传易感性显著相关。在巨噬细胞中C/EBPβ可与TNFAIP3基因的启动子结合,并增加TNFAIP3 m RNA的表达。而在TNIP1基因敲除小鼠中,经典的炎症信号通路NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路未受影响,C/EBPβ功能蛋白亚型LAP(liver-enriched activating protein)及其靶基因产物(Csf3、Nos2及S100a8)表达却显著增加,同时出现狼疮样表现。因此,C/EBPβ可能参与SLE的发病过程,并且在SLE中TNFAIP3、TNIP1和C/EBPβ存在相互的联系。但是目前C/EBPβ在SLE患者中的表达及作用,以及在SLE发病过程中TNFAIP3、TNIP1和C/EBPβ相互关联情况尚不完全明确。目的:探讨SLE患者PBMC中C/EBPβ、TNFAIP3和TNIP1的表达及其与疾病活动的相关性,SLE患者血浆对单核巨噬细胞中C/EBPβ表达的影响,以及单核细胞中TNFAIP3和TNIP1对C/EBPβ表达调节。方法:通过定量PCR(Q-PCR)和蛋白质印迹法(western blot,WB)检测SLE患者和正常对照外周血单一核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中C/EBPβ、TNFAIP3和TNIP1 m RNA和蛋白表达,并分析C/EBPβm RNA表达与疾病活动评分和TNFAIP3/TNIP1 m RNA表达的相关性;通过Q-PCR和WB检测SLE患者和正常对照血浆刺激由THP-1细胞诱导出的单核巨噬细胞后C/EBPβm RNA和蛋白的表达;最后通过TNFAIP3小干扰RNA(si RNA)转染和TNIP1干扰慢病毒感染THP-1细胞,用Q-PCR和WB检测C/EBPβ、TNFAIP3和TNIP1蛋白表达水平;采用Graph Pad Prism 5.0统计学软件组间差异通过Mann-Whitney检验或t检验,其结果表示为±SEM,使用Spearman相关性分析法进行相关性分析。结果:SLE患者PBMC中C/EBPβm RNA表达较正常对照组显著增高(p<0.05)。进一步比较发现:高ANA滴度(≥1:160)患者较低ANA滴度(≤1:80)患者PBMC C/EBPβm RNA表达量增高(p<0.05);抗Sm抗体阳性患者较阴性患者PBMC C/EBPβm RNA表达量增高(p<0.05);抗n RNP抗体阳性患者较阴性患者PBMC C/EBPβm RNA表达量增高(p<0.01)。其余自身抗体阳性患者与阴性患者PBMC C/EBPβm RNA表达量无统计学差异。分析发现:SLE患者PBMC中C/EBPβm RNA表达量与疾病活动度SLEDAI评分呈正相关(p<0.05,r>0);与患者补体C3、C4水平呈显著负相关(p<0.05,r<0)。其余指标无统计学相关性。SLE患者PBMC中C/EBPβm RNA表达与TNFAIP3和TNIP1 m RNA表达正相关(p<0.05,r>0)。SLE患者PBMC中C/EBPβLAP表达较正常对照显著增高(p<0.01);SLE患者PBMC中C/EBPβLIP、TNIP1和TNFAIP3蛋白表达水平较正常对照降低(p<0.05)。SLE患者较正常对照血浆刺激单核巨噬细胞后C/EBPβm RNA表达显著增高(p<0.01);SLE患者血浆刺激单核巨噬细胞后C/EBPβLAP表达较正常对照增高(p<0.05),C/EBPβLIP表达无明显差异(p>0.05)。经TNIP1干扰后THP-1细胞TNIP1蛋白表达较未干扰的THP-1细胞明显降低(p<0.01),C/EBPβLAP蛋白表达较未干扰的THP-1细胞升高(p<0.05);TNFAIP3干扰后THP-1细胞TNFAIP3蛋白表达较未干扰的THP-1细胞降低(p<0.05),C/EBPβLAP蛋白表达较未干扰的THP-1细胞升高(p<0.05)。结论:1.C/EBPβm RNA在SLE患者PBMC中表达升高,与疾病严重程度呈正相关,并高表达于特征性抗体阳性的SLE患者。而且SLE患者PBMC中C/EBPβ蛋白LAP表达升高,LIP蛋白表达降低。提示C/EBPβ参与SLE的发病过程。2.SLE患者PBMC中C/EBPβm RNA表达与TNIP1/TNFAIP3 m RNA表达成正相关,而PBMC中TNIP1和TNFAIP3蛋白表达下降,提示C/EBPβ对TNIP1/TNFAIP3转录有增强作用。3.SLE患者血浆能刺激单核巨噬细胞后C/EBPβm RNA表达显著增高,伴有C/EBPβLAP表达增高,而C/EBPβLIP表达无显著改变,提示SLE患者血浆可以诱导单核巨噬细胞C/EBPβ功能性表达。4.TNIP1干扰后THP-1细胞C/EBPβLAP蛋白表达升高,TNFAIP3干扰后THP-1细胞C/EBPβLAP蛋白表达升高,证明在单核细胞中TNIP1和TNFAIP3蛋白抑制可以诱导C/EBPβ功能性表达。
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