茶树种子脱水敏感性机制及LEA蛋白的鉴定与表达分析

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:tianyi724
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茶树种子是茶树本身自然繁殖的后代,贮藏着完整的遗传信息,作为保存材料具有携带、运输及贮藏方便等优点,但由于其对干燥脱水和低温贮藏的敏感性,导致长期贮藏保存具有较大困难。因此,很有必要开展茶树种子脱水敏感性机制研究。迄今,相关研究主要集中在细胞、生理、生化等水平上,有关分子方面的研究报道甚少。因此,本文选用3个不同干燥脱水处理时期的茶树品种‘鄂茶1号’成熟种子胚为研究材料,采用RNA-Seq高通量测序技术挖掘种子脱水敏感性关键基因;基于测序结果,采用隐马尔可夫模型(HMM)在全基因组水平上对茶树胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)基因家族成员进行鉴定和特性分析,挖掘可能参与茶树生长发育、非生物逆境胁迫(低温、高温、干旱、ABA)及种子脱水(成熟、干燥)过程的相关CsLEA基因。主要研究结果如下:1.成熟茶树种子随着干燥脱水处理时间的延长,萌发率和萌发指数呈现逐渐下降趋势,相对电导率呈现逐渐上升趋势;含水量脱至7.7%时,种子完全丧失活力。由此可见,茶树种子对干燥脱水极为敏感,属于典型的顽拗性种子。2.通过转录组测序,获得100628270条Clean reads,经de novo组装得到91925个Unigenes,平均长度为854 bp,N50值为1480 bp,其中共有58472个(63.6%)Unigenes获得了注释。通过表达谱测序分析发现,525个差异表达基因先上调后下调,482个先下调后上调,5875个持续上调,8929个持续下调,下调基因数明显多于上调基因数。通过对差异表达基因进行GO分析发现,碳水化合物代谢过程、氨基酸代谢过程、辅酶代谢过程等生物学过程显著富集;Pathway分析发现,精氨酸和脯氨酸代谢、脂肪酸生物合成、类胡萝卜素生物合成等通路显著富集。3.通过对测序结果分析发现,与ABA生物合成及信号转导、转录因子、抗氧化酶、LEA蛋白和脯氨酸代谢等在脱水过程起作用的相关基因下调表达,可能是导致顽拗性茶树种子不耐脱水的主要原因。同时,从候选差异表达基因中选取12个进行qRT-PCR验证,结果显示两种方法的一致性达92.2%,表明测序结果具有较高的可靠性。4.通过HMM模型在茶树基因组和转录组数据库中共鉴定出48个CsLEA基因家族成员,根据Pfam结构域和系统进化关系可将其分为LEA 1(2个)、LEA2(32个)、LEA 3(4 个)、LEA4(2 个)、LEA5(1 个)、DHN(4 个)和 SMP(3 个)等7个亚家族。生物信息学分析表明,CsLEA蛋白的分子量介于7.55~49.47 kDa之间,等电点介于4.72~10.16之间,大多数属于亲水性蛋白,主要分布于细胞质、细胞核和叶绿体等细胞结构中。保守基序分析表明,CsLEA蛋白在同一亚家族内的motif具有高度保守性,但不同亚家族间差异较大。5.qRT-PCR分析结果表明,除CsLEA39基因在种子中特异表达外,其余47个CsLEA基因在茶树根、茎、叶、花和种子中均有表达,其中24个在根中最高表达、14个在种子中最高表达、5个在花中最高表达、3个在茎中最高表达和2个在叶中最高表达。此外,还发现23个CsLEA基因受低温胁迫诱导表达,44个CsLEA基因受高温胁迫诱导表达,33个CsLEA基因受干旱胁迫诱导表达,28个CsLEA基因受ABA处理诱导表达,其中11个CsLEA基因对低温、高温、干旱和ABA处理均有响应。6.研究发现,47个CsLEA基因在茶树种子生长发育过程中被诱导表达,其中39个在种子成熟脱水期(10月)上调表达;14个CsLEA基因在茶树种子干燥脱水处理过程中被诱导表达,其中8个在种子干燥脱水时下调表达。7.CsLEA11、CsLEA32、CsLEA36和CsLEA45等4个CsLEA基因在种子干燥脱水过程中的抑制表达可能是导致顽拗性茶树种子不耐脱水的重要原因。
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